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liuliancy铁杆木虫 (正式写手)
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[求助]
离子交换层析（deae-纤维素）出峰差异很大（有图谱）
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昨天用DEAE-纤维素过柱子，图谱如1，目标蛋白跟杂蛋白差没分开，今天用相同的缓冲液相同的上样量和样品，结果却一点都没分开，柱子1*20，上样2ml，梯度洗脱液为50mL 20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，得到的图谱却是2和3的样子，请教各位长辈这是为什么？洗脱液要怎么调节才能将得到较好的洗脱效果？ 图1  图2  图3  [ 来自科研家族 生物医药家族 ] |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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【答案】应助回帖
★ ★
adslye(金币+2, BioEPI+1): 鼓励经典~祝顺利！ 2011-08-18 09:20:19
liuliancy(金币+3): 感谢老大！！！ 2011-08-18 09:27:20
adslye(金币+2, BioEPI+1): 鼓励经典~祝顺利！ 2011-08-18 09:20:19
liuliancy(金币+3): 感谢老大！！！ 2011-08-18 09:27:20
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1、我没听说过Tris-醋酸这个缓冲液，你有没有试过Tris-盐酸缓冲液？ 2、你的两个洗脱液用的是20mmo/L pH7.5 Tris一乙酸缓冲液和50ml 50mmol/L pH5.0Tris一乙酸缓冲液(含0.3mol/L 氯化钠)，看来你是想用pH梯度和离子强度一起来制造一个洗脱梯度，这样做有什么依据吗？我认为这样会引入误差，因为两个因素制造的梯度可控制性可能会弱于一个因素。如果用pH值，不知道稍低的pH值会不会引起蛋白质失活，所以我喜欢用离子强度作为洗脱梯度，起始缓冲液和洗脱缓冲液的pH值相同，但是氯化钠分别为0和1M，能制作出一条从0-1M的连续线性梯度。这样结果也更好分析。 3、两个峰即使是顶点能分开，但交叉很大也是不纯的。DEAE在我的实验里分离效果差，比不上其它的阴离子交换层析柱，如果有别的层析柱，也可以联用。 4、层析柱1*20没有意义，计算柱体积才有意义。 |
2楼2011-08-18 00:06:28
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5楼2011-08-19 00:47:10
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8楼2011-08-19 21:32:30
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【答案】应助回帖
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silicare(金币+8, BioEPI+1): 辛苦了 2011-08-20 09:55:45
liuliancy(金币+3): 收到！！！老大辛苦了...一定要成功！！！一切皆有可能！！！！ 2011-08-20 10:53:49
silicare(金币+8, BioEPI+1): 辛苦了 2011-08-20 09:55:45
liuliancy(金币+3): 收到！！！老大辛苦了...一定要成功！！！一切皆有可能！！！！ 2011-08-20 10:53:49
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你的主要峰大概为三个，但是第一个峰是非常靠近0点，说明有很多弱吸附的蛋白质，这些蛋白质可能会被起始缓冲液冲洗下来，现在你没有平衡步骤，所以有可能会影响吸附得稍微强一些的蛋白质出峰，造成蛋白质的重叠。假如加入平衡步骤，你的第一个峰可能高度会下降一些，峰形状可能也会有所变化。这仅是分析，由于你的蛋白质在后面出来，所以第一个峰无论怎样都不要紧，所以我认为除非你的蛋白质较前出来才要平衡，现在你不用平衡也可以，虽然得不到本来的峰形状，但没关系。 从图2（20mM tris-hcl ph7.5和20mM tris-hcl ph7.5（含NaCl 1M））看出，你的蛋白质在中间稍前出来，此时的电导率约为35-40%，所以我推测你的蛋白质等电点约为5.0-5.5。 假设你的四次实验的样品上样量一样，那么可以初步从峰的高度来推测所受蛋白质干扰的程度。图1的峰高度最低，推测含有杂质蛋白质最少。与其它峰之间构成的峰谷高度（主要为第二个峰）也能指示蛋白质之间的分离效果，虽然图4最小为0.12，但是峰3过高，说明杂质蛋白质极多；虽然图3较小为0.35，但是峰1过细，难以断定峰1右侧的小峰是否为峰2，而目的蛋白质所在的峰左侧有不平滑处，有可能是峰2，所以可能峰3收到了峰2的干扰；图2中峰形状最好，三个峰之间很明显能分开，分离效果我觉得较好；图1中虽然峰2和3之间分得不开，但峰3的高度是最低的，说明杂质蛋白质可能较少，同时峰2、3之间隐约有个不算太明显的小峰，因为峰2、3的高度较矮，所以可能是属于峰2、3的蛋白质有些被合并到中间去了。 综上所述，我觉得分离效果由好至差可能是1、2、3、4，但是2比1可能稍差而不是差得很明显，建议选用1，2作为备用。同时将四次层析有酶活力的收集管跑SDS-PAGE，依据蛋白质条带来确认分离效果。由于是第一步纯化，可能蛋白质条带较多，但是可能可以推测。 生物学实验一切皆有可能，所以我只说可能。 |
12楼2011-08-20 05:36:20
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峰的顶点不尖锐有两个可能的原因： 1、含有的蛋白质种类很多，且蛋白质性质极其接近，出峰时紧挨着，导致各个蛋白质峰相互交叉，表现为一个总的线条平缓的峰。 2、层析柱的分辨率太差，且填料不均匀，在填料松散的地方洗脱液很容易就能将蛋白质洗脱下去，但在紧密的地方不容易洗脱，导致本应该出来的蛋白质延后，表现为峰曲线平缓。 从你这个曲线来看，大致可以分为3个峰，第一个峰为非常平缓的，且顶点高度为第二、三个峰的基线，第2、3两个峰的顶点不尖锐，说明这两个峰各自含有的蛋白质都非常多，说明即使是能把这两个峰分开，蛋白质也是不纯的。两个峰之间的峰谷距离基线极远，说明交叉极其严重，如果不是层析柱的装填质量差，那么无论怎么优化，它们都不能分得开。 DEAE是弱阴，如果强阴可能会分离效果好一些。填料方面，如果有条件，可以试一下Mono Q，强阴，填料硬一些。 |
16楼2011-08-24 23:20:27
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silicare(金币+10, BioEPI+1): 2011-08-25 08:03:05
liuliancy(金币+1): 2011-08-25 09:29:11
silicare(金币+10, BioEPI+1): 2011-08-25 08:03:05
liuliancy(金币+1): 2011-08-25 09:29:11
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原来是求助帖，图片都不能直接附上真麻烦。 峰的顶点不尖锐有两个可能的原因： 1、含有的蛋白质种类很多，且蛋白质性质极其接近，出峰时紧挨着，导致各个蛋白质峰相互交叉，表现为一个总的线条平缓的峰。 2、层析柱的分辨率太差，且填料不均匀，在填料松散的地方洗脱液很容易就能将蛋白质洗脱下去，但在紧密的地方不容易洗脱，导致本应该出来的蛋白质延后，表现为峰曲线平缓。 从你这个曲线来看，大致可以分为3个峰，第一个峰为非常平缓的，且顶点高度为第二、三个峰的基线，第2、3两个峰的顶点不尖锐，说明这两个峰各自含有的蛋白质都非常多，说明即使是能把这两个峰分开，蛋白质也是不纯的。两个峰之间的峰谷距离基线极远，说明交叉极其严重，如果不是层析柱的装填质量差，那么无论怎么优化，它们都不能分得开。 DEAE是弱阴，如果强阴可能会分离效果好一些。填料方面，如果有条件，可以试一下Mono Q，强阴，填料硬一些。用DEAE出来一个峰的样品用Mono Q可以分出4个峰。   |
17楼2011-08-24 23:24:17
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18楼2011-08-24 23:28:43
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26楼2012-03-13 02:17:58
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