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tingl0087

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[求助] PCR扩增中GC含量退火温度的问题

请问一下，要扩一个基因3.5k，GC含量为45%，可是有一条引物的GC含量是63%，另一条为40%，Tm值分别为71°和58°（生工合成单上的温度），我用Takara 的primeSTAR HS扩，第一次以基因组为模板扩用56°扩出来了，很亮，切胶回收后，做模板，同样条件再扩，就是弥散的一片，重复几次都这样，怎么办呢，我没有基因组了，再提一次很麻烦的。。。

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1楼 2011-08-15 00:07:39

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blackrose8089

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone(金币+3): 鼓励 2011-08-15 11:21:20
tingl0087(金币+1): 恩，有道理，一会重新做个PCR试试~谢谢了~ 2011-08-15 16:27:06

以前遇到过类似的问题,也是takara的primer star，原因可能有两个：
1 模板浓度太大，以前曾经以质粒为模板扩过，原液浓度是测序后的样品，发现在稀释到一万倍后才有十分特异的条带，100，1000倍的都像地毯一样，泳道弥散。
2 模板质量不是太好，primer star的保真性好，可以扩增长片段，以前扩过7.3k的片段，但同时它对模板质量要求也高，建议楼主看一下回收的产物质量如何！
供楼主参考！