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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 做RT-PCR的战友们，内标定量怎么做？
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muchong5577

金虫 (正式写手)

[求助] 做RT-PCR的战友们，内标定量怎么做？

从来没做过内标定量的荧光定量PCR，有战友做过这个没？内标定量有什么优点？具体怎么做？初次接触，望大家帮我解答这些疑问。告诉我这方面的文献资料也行。谢谢了！
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1楼 2011-08-09 10:31:58
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muchong5577

金虫 (正式写手)
期待高手的帮助
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2楼2011-08-09 16:09:59
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
muchong5577(金币+5): 非常感谢！ 2011-08-10 09:42:41
lstt09nk(金币+5, BioEPI+1): 我也要做这个，感谢分享~~ 2011-08-11 13:06:15
1.内标定量？是指的内参吧？reference gene ？是这个吗？
2.real-time 定量有三种：标准曲线法，双标准曲线法，DELTA DELTA CT法。（PS.没有楼主说的内标定量法）
   标准曲线法：是精确定量，知道具体的表达数，一般应用于医院检测病毒携带数（乙肝病毒数）。
   后面两者是相对定量，知道A和B之间的关系，比如：A是B的多少倍。用于处理组和非处理组之间的基因表达差异。
一般认为绝对定量可以不用内参，相对定量使用内参。
3.具体操作过程。个人感觉楼主初次接触，还是看些资料吧。
生物秀这个栏目还可以http://ask.bbioo.com/special/experiment/RealtimePCR.htm
推荐这本书《Real-time PCR》  网上有下，我就不上传了。
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3楼2011-08-09 16:39:41
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missoulmate

金虫 (小有名气)
RT-PCR 是反转录PCR
楼主说的应该是RealTime-PCR吧
根据内参和你做的引物得到一个标曲，然后再做后面的。
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4楼2011-08-09 22:57:43
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muchong5577

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by adslye at 2011-08-09 16:39:41:
1.内标定量？是指的内参吧？reference gene ？是这个吗？
2.real-time 定量有三种：标准曲线法，双标准曲线法，DELTA DELTA CT法。（PS.没有楼主说的内标定量法）
   标准曲线法：是精确定量，知道具体的表达数 ...

我是想，在RealTime-PCR中有内标，能不能这样：使内标既能当传统的内标使用，监测假阳性、体系中有无抑制剂等；另外，内标又能做定量的标准品，既与绝对定量中已知浓度的A、B、C、D一样的作用。
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5楼2011-08-10 09:47:30
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


muchong5577(金币+2): 2011-08-12 08:44:43
引用回帖:
5楼: Originally posted by muchong5577 at 2011-08-10 09:47:30:
我是想，在RealTime-PCR中有内标，能不能这样：使内标既能当传统的内标使用，监测假阳性、体系中有无抑制剂等；另外，内标又能做定量的标准品，既与绝对定量中已知浓度的A、B、C、D一样的作用。

1.您的实验目的是什么？是绝对定量还是相对定量？
2.我说的内参是基因，是引物。感觉您的内标是模板。我理解的对吗？
3.如果您要做绝对定量，绝对定量中已知浓度的样本是什么都可以，只要干净，浓度准确即可。
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muchong5577
6楼2011-08-10 10:18:37
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muchong5577

金虫 (正式写手)
送鲜花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by adslye at 2011-08-10 10:18:37:
1.您的实验目的是什么？是绝对定量还是相对定量？
2.我说的内参是基因，是引物。感觉您的内标是模板。我理解的对吗？
3.如果您要做绝对定量，绝对定量中已知浓度的样本是什么都可以，只要干净，浓度准确即可。

您好！谢谢您！
1. 我说的内标是人工合成的小片度基因，加上扩增这段基因的一对引物，其中一条引物有荧光标记；
2. 实验的目的是：不使用已知浓度的定量参考品ABCD，而使用内标定量样品中的模板DNA浓度，是绝对定量。
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7楼2011-08-10 10:49:36
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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优秀版主

【答案】应助回帖

muchong5577(金币+2): 2011-08-12 08:45:02
引用回帖:
7楼: Originally posted by muchong5577 at 2011-08-10 10:49:36:
您好！谢谢您！
1. 我说的内标是人工合成的小片度基因，加上扩增这段基因的一对引物，其中一条引物有荧光标记；
2. 实验的目的是：不使用已知浓度的定量参考品ABCD，而使用内标定量样品中的模板DNA浓度，是绝对 ...

扩增效率是个主要问题
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8楼2011-08-10 11:56:37
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adslye

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

muchong5577(金币+5): 谢谢您！ 2011-08-11 10:59:44
引用回帖:
7楼: Originally posted by muchong5577 at 2011-08-10 10:49:36:
您好！谢谢您！
1. 我说的内标是人工合成的小片度基因，加上扩增这段基因的一对引物，其中一条引物有荧光标记；
2. 实验的目的是：不使用已知浓度的定量参考品ABCD，而使用内标定量样品中的模板DNA浓度，是绝对 ...

您好，绝对定量我没做过。但我在AB公司培训过，了解一点。
我记不清有哪种方法是一条引物带荧光来定量的。
目前就2种方法吧：探针和染料法。

不是太明白您的描述,以下为我猜测后的看法：
您是在研究新的方法？我觉得您的研究目对实际没有什么帮助。因为在定量上公司已经做得很成熟了。和公司比做方法学，难度不小额。

而且，弱弱地说一句，荧光定量PCR的应用受新技术挑战地位岌岌可危啊。
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9楼2011-08-10 14:04:13
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adslye

银虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by silicare at 2011-08-10 11:56:37:
扩增效率是个主要问题

绝对定量扩增效率不需要考虑吧。因为在P标准品和样品的时候，引物是一样的。
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10楼2011-08-10 14:05:31
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