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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 做RT-PCR的战友们，内标定量怎么做？
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silicare

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10楼: Originally posted by adslye at 2011-08-10 14:05:31:
绝对定量扩增效率不需要考虑吧。因为在P标准品和样品的时候，引物是一样的。

影响扩增效率的可不仅仅是引物，基本相同酶体系，模板的干扰物仍然很重要，P基因组和P质粒是完全不同的难度
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11楼2011-08-10 16:29:19
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adslye

银虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by silicare at 2011-08-10 16:29:19:
影响扩增效率的可不仅仅是引物，基本相同酶体系，模板的干扰物仍然很重要，P基因组和P质粒是完全不同的难度

的确会影响，但在荧光定量里面基本不考虑模板的干扰。因为主要是测cDNA的量。反转录后的体系对PCR没大影响。
而标准品更可能是质粒等制备好的东西，也不会大量含抑制PCR的物质。
总之，荧光定量PCR的模板都是为定量特制的，本来就对PCR影响不大，如果要考虑模板的影响，荧光定量就没办法进行了。
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12楼2011-08-10 21:23:04
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silicare

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【答案】应助回帖

muchong5577(金币+1): 2011-08-12 08:45:21
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12楼: Originally posted by adslye at 2011-08-10 21:23:04:
的确会影响，但在荧光定量里面基本不考虑模板的干扰。因为主要是测cDNA的量。反转录后的体系对PCR没大影响。
而标准品更可能是质粒等制备好的东西，也不会大量含抑制PCR的物质。
总之，荧光定量PCR的模板都是为 ...

看看文献比例就知道了，为什么做基础研究的没几个人做绝对定量，就是因为他太不靠谱了
而相对定量一直有两种做法，也是纠结在扩增效率，之所以大家都在说效率低就换引物，那是因为想换模板他们换不了
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13楼2011-08-11 08:15:03
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adslye

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+5): 很认真，鼓励交流 2011-08-11 13:19:26
引用回帖:
13楼: Originally posted by silicare at 2011-08-11 08:15:03:
看看文献比例就知道了，为什么做基础研究的没几个人做绝对定量，就是因为他太不靠谱了
而相对定量一直有两种做法，也是纠结在扩增效率，之所以大家都在说效率低就换引物，那是因为想换模板他们换不了

相对定量中的双标准曲线法，就是应用在扩增效率不同的情况。很多情况下引物不好换，一段基因中刚好产物在150-200作用的区域两边又合适做引物的地方也不是很多。

同样逆转录的模板差异会很大吗？我不这样认为，每管中的成分很相似。模板一样也就不存在模板造成的两管间扩增效率的差异。公式法要求扩增效率也只是因为公式的推导是基于扩增效率为1的假设。

最后，PCR毕竟是体外扩增，40个循环中发生什么，微观条件下什么都可能，从这个角度看PCR定量本来就是有缺陷的。但每一种定量都没那么完美。目前应用探针法的荧光定量PCR还是很受认可的。

最后，一般很少有科研机构会对这种定量方法研究感兴趣吧。和几家大公司去竞争，从课题角度就有难度。
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14楼2011-08-11 10:34:21
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muchong5577

金虫 (正式写手)
你们说荧光定量PCR怎么都只包括样本为RNA的PCR？
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15楼2011-08-11 11:14:09
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muchong5577

金虫 (正式写手)
是我没说好，呵呵 RT-PCR和Real-Time PCR有区别。
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16楼2011-08-11 11:17:36
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muchong5577

金虫 (正式写手)
求高人指导啊，内标定量怎么做？貌似现在只有Roche在做？
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17楼2011-08-16 20:07:02
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riico

新虫 (初入文坛)
哥们，内标准定量我在做，有兴趣可以交流一下
utunbu@Gmail.com
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18楼2012-07-18 10:26:50
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刘慈1988

新虫 (初入文坛)
谁会在软件里做标准曲线啊？
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天道酬勤
19楼2013-04-03 15:40:12
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