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muchong5577金虫 (正式写手)
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[求助]
做RT-PCR的战友们，内标定量怎么做？
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| 从来没做过内标定量的荧光定量PCR，有战友做过这个没？内标定量有什么优点？具体怎么做？初次接触，望大家帮我解答这些疑问。告诉我这方面的文献资料也行。谢谢了！ |
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lstt09nk(金币+5): 很认真，鼓励交流 2011-08-11 13:19:26
lstt09nk(金币+5): 很认真，鼓励交流 2011-08-11 13:19:26
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相对定量中的双标准曲线法，就是应用在扩增效率不同的情况。很多情况下引物不好换，一段基因中刚好产物在150-200作用的区域两边又合适做引物的地方也不是很多。 同样逆转录的模板差异会很大吗？我不这样认为，每管中的成分很相似。模板一样也就不存在模板造成的两管间扩增效率的差异。公式法要求扩增效率也只是因为公式的推导是基于扩增效率为1的假设。 最后，PCR毕竟是体外扩增，40个循环中发生什么，微观条件下什么都可能，从这个角度看PCR定量本来就是有缺陷的。但每一种定量都没那么完美。目前应用探针法的荧光定量PCR还是很受认可的。 最后，一般很少有科研机构会对这种定量方法研究感兴趣吧。和几家大公司去竞争，从课题角度就有难度。 |
14楼2011-08-11 10:34:21
muchong5577
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【答案】应助回帖
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muchong5577(金币+5): 非常感谢！ 2011-08-10 09:42:41
lstt09nk(金币+5, BioEPI+1): 我也要做这个，感谢分享~~ 2011-08-11 13:06:15
muchong5577(金币+5): 非常感谢！ 2011-08-10 09:42:41
lstt09nk(金币+5, BioEPI+1): 我也要做这个，感谢分享~~ 2011-08-11 13:06:15
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1.内标定量？是指的内参吧？reference gene ？是这个吗？ 2.real-time 定量有三种：标准曲线法，双标准曲线法，DELTA DELTA CT法。（PS.没有楼主说的内标定量法） 标准曲线法：是精确定量，知道具体的表达数，一般应用于医院检测病毒携带数（乙肝病毒数）。 后面两者是相对定量，知道A和B之间的关系，比如：A是B的多少倍。用于处理组和非处理组之间的基因表达差异。 一般认为绝对定量可以不用内参，相对定量使用内参。 3.具体操作过程。个人感觉楼主初次接触，还是看些资料吧。 生物秀这个栏目还可以http://ask.bbioo.com/special/experiment/RealtimePCR.htm 推荐这本书《Real-time PCR》 网上有下，我就不上传了。 |
3楼2011-08-09 16:39:41
4楼2011-08-09 22:57:43
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