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初级选手，请帮忙看看设计的引物是否合适。谢谢
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各位CC们： 初学RT-PCR，设计引物不知道成功与否。 要做的是caco-2（人的结肠癌细胞）中的转运蛋白的m RNA表达。 设计了几个引物 ，用primer设计的，但是不知道合适否，请帮忙看看，能够同时给出退火温度，退火温度是否可以用primer中的Ta opt？ SGLT1（ACCESSION NM_000343）: 5' CTTCCTTTAGTCTCGTCCTG 3' 5' CTTCCTTTAGTCTCGTCCTG 3' product：495bp GLUT2（ACCESSION NM_000340） 5' CCGCTGAGAAGATTAGAC 3' 5' CTGGATACAGACAGGGAC 3' product：492bp GAPDH（ACCESSION NM_002046）: 5' GGATTTGGTCGTATTGGG 3' 5' GCTCCTGGAAGATGGTGAT 3' product：211bp 谢谢 还有个很菜的问题，Tm 和Ta opt 有什么不同啊？ 可以利用软件中的数值嘛？为什么差别那么大啊？ 谢谢谢谢 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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gwbk
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-15 10:32:03
amaya1545(金币+10): 2011-07-15 17:10:45
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-15 10:32:03
amaya1545(金币+10): 2011-07-15 17:10:45
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1，产物Tm=81.5 + 16.6 log [K+]/ 1+0.7[K+] + 0.41 %G + %C - 500/length 盐浓度即[K+] 在参数设定preferences 中也称为Na+ 当量也是由上述公式得来产 物的GC% 和长度也要考虑在内。 2，最适宜退火温度计算公式Ta Opt PRIMER PREMIER 使用Rychlik的公式文献11 自动预测引物对的优化退火温度在 PCR反应的退火步骤使用该优化退火温度能提高目的产物产量并减少错误的产物 Ta Opt = 0.3 引物Tm + 0.7 产物Tm – 25 3，一般设计引物，都是看Tm-5值，不看Ta Opt值，而且primer给出的Ta Opt都是产物值。仅做参考。 4，第一对引物相同的？ 5，CTGGATACAGACAGGGAC 3'引物二聚体△G=-7.6，有点高，理论绝对值小于4.5. 6，3‘△G略高，建议3’端用T，GC其次。 |
2楼2011-07-14 21:26:34
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1. Tm ：就是可以用PRIMER软件中上下游引物的Tm 来用，没必要自己计算是吧？ 我的PCR的试剂盒说明书上，退火温度最好在55-65℃之间，这样是否意味着我设计的引物的Tm要在60℃左右啊？但是好多成对出现的结果不能保证这样 2. 引物设计时是Pairs 还是单独sense 和antisense，有个师兄介绍说，单独设计，先保证Tm ，G+C含量，而后再考虑是否有Harpin，Dimer等等。如果这两个合适，但是有很多Found不会影响太多嘛？ 3. 您说的那个“引物二聚体△G=-7.6，有点高，理论绝对值小于4.5.”这个我可以在哪里看到啊？ 4.关于3‘端，我看到引物设计上也说最好不用G,C，但是可能用的时候就没有注意了。 不过感觉还是很多不明的，觉得设计好引物真的好难啊。之前用的别人的文献里的，用PRIMER检测，也觉得不好。 最后，您能不能在忙中给俺设计下啊  |
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3楼2011-07-15 17:50:09
gwbk
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 这还是第一次在同一个帖子，连续对同一个ID授予两次EPI，我不知道算不算违规，但是没有规定。对于你的出色热心，我还是给与了。加油！ 2011-07-15 19:02:35
dhd997(金币+5, EPI+1): 这还是第一次在同一个帖子，连续对同一个ID授予两次EPI，我不知道算不算违规，但是没有规定。对于你的出色热心，我还是给与了。加油！ 2011-07-15 19:02:35
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1，Tm值没必要自己算的，我只是拷贝了Primer自带的说明书而已。Tm不一定非要在60℃左右，只要一对引物Tm相近，PCR的时候不降低效率就行了。 2，引物我都是单独设计的。设计好了，再看一对引物合不合适，主要看Tm值是否相近，能不能形成二聚体。 3，一般情况，理论上，引物二聚体和发卡结构△G都是不能超过4.5的。 4，不是最好不用G、C，可以用G、C的，但是绝对不能用A。 在网上找了很多引物设计资料，都是乱七八糟的。只有这一篇总结的相当好。 另外，把这个FUCKING MANUAL无聊的东西也传给你，还好是中文的，当你问题解决不了的时候，去找MANUAL吧~~~~~什么教程指导都代替不了MANUAL的，但同时也是最无聊不受欢迎的东西。 |
4楼2011-07-15 18:57:02
gwbk
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