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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物不到200bp条带模糊
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ghj042

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物不到200bp条带模糊

大家看看怎么回事，回收后进行了PCR，出现了这样的情况，从做到右退火温度依次为45,50,55,60.下面的那个是不是引物二聚体？这样的条带能回收吗？
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1楼 2011-07-03 11:46:51
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healerly

禁虫 (小有名气)
★ ★
ghj042(金币+1): 谢谢，很有帮助，我回收试试 2011-07-03 15:54:53
dhd997(金币+2): good 2011-07-03 18:11:30
本帖内容被屏蔽
2楼2011-07-03 14:52:27
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-07-03 18:11:39
退火用60度，建议回收的时候用高浓度胶（如2.0%）跑，这样目的条带和引物二聚体分的比较开。
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3楼2011-07-03 17:38:23
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-07-03 21:38:31
1：marker各是多大呢？最好标清楚；
2：选最右边的进行大量pcr。。这样的情况可以调整胶的浓度，改变电压，但是我的经验是切胶，因为200bp确实很小，引物二聚体也比较小，切胶的话比较纯，可以得到你的目的条带。。也很方便。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2011-07-03 19:58:12
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ghj042

新虫 (初入文坛)
西瓜: 同学，不是每个人都用和你一样的maker的，可以的话把条带大小标出来吧。 2011-07-04 09:37:22
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-07-03 19:58:12:
1：marker各是多大呢？最好标清楚；
2：选最右边的进行大量pcr。。这样的情况可以调整胶的浓度，改变电压，但是我的经验是切胶，因为200bp确实很小，引物二聚体也比较小，切胶的话比较纯，可以得到你的目的条带。 ...

marker是DL2000的，就是有点模糊，听人说回收的质量不是很好，希望高手指点怎么调整体系或者才采取什么方法能够解决这个模糊的现象。
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5楼2011-07-03 21:48:51
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ghj042

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-07-03 17:38:23:
退火用60度，建议回收的时候用高浓度胶（如2.0%）跑，这样目的条带和引物二聚体分的比较开。

比较开以后能够用来回收吗？切胶质量能过关吗？
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6楼2011-07-03 21:49:39
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ghj042

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by healerly at 2011-07-03 14:52:27:
60摄氏度的比较好吧~~
可以回收，建议：不过需要切胶回收，电泳时电压调的稍微小一点，跑的时间长一点，可能电泳液需要换了，一般要回收的话最好用新的电泳液，不然要是有拖尾就不好了，就想你现在跑的，稍微有点 ...

这样稍微有点拖尾的话能够用来回收吗？会影响连接和测序吗？
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7楼2011-07-03 21:50:33
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by ghj042 at 2011-07-03 21:50:33:
这样稍微有点拖尾的话能够用来回收吗？会影响连接和测序吗？

可以回收的，大部分情况下回收后引物条带就不见了，可以进行连接和测序的。。。

但是如果引物太亮了最好切胶回收吧。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2011-07-03 22:03:19
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ghj042

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-07-03 22:03:19:
可以回收的，大部分情况下回收后引物条带就不见了，可以进行连接和测序的。。。

但是如果引物太亮了最好切胶回收吧。。。

恩，回收后进行琼脂糖电泳检测是没有引物了，但是条带很淡，能做链接吗?能够链接成功吗
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9楼2011-07-03 22:53:33
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
西瓜(金币+2): 同意！没跑开就切没有意义。 2011-07-04 09:36:15
引用回帖:
Originally posted by ghj042 at 2011-07-03 21:49:39:
比较开以后能够用来回收吗？切胶质量能过关吗？

分开之后不是更好切胶回收，没分开就切胶回收才是问题呀！
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10楼2011-07-04 08:06:59
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