| 查看: 4206 | 回复: 31 | ||||||||
| 本帖产生 2 个 MolEPI ，点击这里进行查看 | ||||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||||||||
天使托专家顾问 (职业作家)
T.Shen
|
[交流]
【原创经验篇】由一个简单的酶切重组载体想到的.......... 已有20人参与
|
|||||||
不得不承认，有时候做实验确实运气有很大关系；前段时间，做啥出啥，那叫一个顺利呀。。。 可是最近，有些低迷，就拿很简单的一个双酶切，耽搁了偶2天时间，如果让小老板知道了，那完了，狂风暴雨一般呀。。。本人原帖：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3350346&fpage=1 首先感谢回复的各位童鞋们，你们的建议很有用，我谢谢了，随后BB一一奉上，请注意查收！  目前本人双酶切已经彻底搞定，目的基因已经成功连接至载体上了，其实即便没有双酶切的图我也可以证明，见后面！ 虽说一个简单的双酶切，没什么大不了的，确实没有什么大不了的，可是小问题往往能够反映出大智慧。。。相信一个谨慎的科研者在细节上肯定做的很好，正如最近一部比较火爆的电视剧《裸婚时代》：细节打败爱情，同样我这里想说的是：细节打败实验，如果你留心一下，看看你们实验室大家平时的做实验的习惯，你便可以看出来这个人的实验结果以及种种。。。我们实验室便是如此！ 貌似扯得有些远了，其实想说的就是细节这个东西，尤其在科研上，很重要，非常重要！不要因为它小便觉得无所谓，便觉得小case，其实不然，小细节做好了，那么大事绝对成矣，只不过是迟早的事！ 其实酶切这个东西吧，看似简单，其实讲究很多。。。当然各种方法体系网上到处都是，包括公司的说明书上，这里我讲的是我的一些想法，还请各位指正！ 就拿我这酶切验证重组载体吧，首先大体说说基本步骤： 1：双酶切载体，然后电泳看是否切开，如果没有切开，有可能是酶太少，也有可能是作用时间不够，切忌这个时候不能直接纯化然后去做连接，当然了可以做连接，但是成功率太低，浪费了东西不说，宝贵的时间也会浪费，所以一定要保证载体酶切的很干净，一点拖尾都不能有，然后纯化一下，当然了纯化是个浓缩的过程，比如我切50ul的体系，最后纯化的时候，终体积20-30ul即可，然后点样看看怎么样？这一块有一个小细节，就是点完样之后，可以把其它的纯化产物继续加到柱子上（现在大家基本都用试剂盒进行纯化吧，所以离心柱你懂的）！让它继续..... 2：酶切基因，其实这一步很简单，没有什么特殊要求，过夜酶切或者切它8 9 10个小时都行，随后进行纯化，纯化终体积见上面；最后点样看亮度。。。 3：连接：连接之前呢，先将载体和基因混合，热活化一下，即45度10min，然后加连接酶，buffer，ddH2O；体系不用我说了，大家应该很清楚了，我的原则呢，基因比载体多些。。。 4：转化：转化前45度活化10min，然后转化进大肠杆菌感受态。。。涂布于加抗生素的板子上，这一步因载体不同，抗性标记也不同，筛选标记也不同，常见的就是蓝白斑筛选了，涂布X-gal少不了，过夜培养，一般18-24h,之后长出来的很少有对的。。。挑几个疑似连接上的单克隆划线第二天验证。。。 5：验证：<1>PCR，可以作为初步筛选，用几个菌的裂解液当模板进行PCR，原来坛子上有人建议用快检的方法，也可以；PCR出来点样，有条带的那基本就对了； <2>能P出来的菌，提质粒，然后双酶切验证，验证对了基本你的克隆也就搞定了，下一步呢？可以测你想要的很多数据了。。。。因各种实验不同，以下就不赘述了。。。。 目前本人已经成功进行双酶切验证了，至于什么问题呢，大家如果感兴趣，见上面链接，直接上图  泳道1：marker 泳道2：载体digest 泳道3：gene digest 泳道4,5：重组载体 digest 我连接的这个片段500bp,虽说不大，可是做一个漂亮的双酶切，得到底下那条基因的条带还是比较难的，不过今天我重新提了质粒，质粒比较亮，然后多切了一些，这才勉强得到这张图，大家轻拍。。。呵呵！ 所以大家如果以后连接小片段的话，尤其是小片段练到大载体上的话，提取的重组质粒一定要亮，质量一定要大，不然做双酶切验证那是何其的困难啊。。。我原先提取的重组载体不是很亮，然后双酶切，只有上面载体的条带，底下基因的那条木有啊，就是木有，你说郁闷不郁闷？所以切记：质粒一定要亮！ 当然了，酶切验证的体系呢，一般10ul就可以了，但是如果片段小的话，就像我这种情况，也可以切20ul体系的。。。 说了这么多，其实是本人的一些心得吧，拿来与大家分享，希望大家实验都顺利进行，每天像打鸡血一样进行实验，实验结果刷刷刷的往出蹦。。。呵呵呵！ [ Last edited by 天使托 on 2011-7-1 at 22:33 ] |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 载体构建 | 软件 | 【分子生物】EPI帖 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
西瓜» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有149人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求真菌表达载体pBARGPE1的酶切方法！！！
已经有11人回复
- 重组质粒双酶切问题
已经有5人回复
- 【求助】基因克隆T载体酶切问题等
已经有8人回复
- 用于表达的重组载体构建后需要测序吗？
已经有6人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 载体酶切
已经有13人回复
- 在基因重组过程中，怎样鉴别质粒载体是否被限制性内切酶切好？
已经有10人回复
- 【求助/交流】片段转进去，提质粒酶切发现载体小了，想不明白
已经有19人回复
- 【求助/交流】大家酶切载体怎么切？一般切多久？
已经有6人回复
- 【分享】关于载体双酶切的一些经验
已经有19人回复
- 【求助/交流】关于重组载体鉴定
已经有4人回复
- 【求助/交流】单酶切载体竟然没切开，寻求原因？？
已经有15人回复
西瓜
荣誉版主 (知名作家)
- MolEPI: 50
- 应助: 94 (初中生)
- 贵宾: 3.157
- 金币: 1849.6
- 散金: 11458
- 红花: 116
- 沙发: 21
- 帖子: 7553
- 在线: 1449.5小时
- 虫号: 271749
- 注册: 2006-08-13
- 性别: GG
- 专业: 细胞衰老
- 管辖: 分子生物
3楼2011-07-01 23:56:54
gwbk
木虫 (正式写手)
- MolEPI: 54
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2293.5
- 红花: 24
- 帖子: 529
- 在线: 186.9小时
- 虫号: 1320681
- 注册: 2011-06-11
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
2楼2011-07-01 23:07:14
xiaoweiwei121
荣誉版主 (文坛精英)
这潭水蓝的深邃
- MolEPI: 5
- 应助: 18 (小学生)
- 贵宾: 39.097
- 金币: 106416
- 散金: 2773
- 红花: 197
- 沙发: 109
- 帖子: 35580
- 在线: 2157.8小时
- 虫号: 426591
- 注册: 2007-07-28
- 性别: MM
- 专业: 蛋白质组学
- 管辖: 虫友互识
4楼2011-07-02 05:08:13
nnxqwei
至尊木虫 (职业作家)
- MolEPI: 1
- 应助: 4 (幼儿园)
- 贵宾: 0.01
- 金币: 44453.4
- 散金: 66
- 红花: 110
- 帖子: 4691
- 在线: 781.4小时
- 虫号: 50626
- 注册: 2004-07-13
- 性别: GG
- 专业: 微生物学
5楼2011-07-02 11:47:21
