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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【原创经验篇】由一个简单的酶切重组载体想到的..........
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

[交流] 【原创经验篇】由一个简单的酶切重组载体想到的.......... 已有20人参与

不得不承认，有时候做实验确实运气有很大关系；前段时间，做啥出啥，那叫一个顺利呀。。。 可是最近，有些低迷，就拿很简单的一个双酶切，耽搁了偶2天时间，如果让小老板知道了，那完了，狂风暴雨一般呀。。。

本人原帖：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3350346&fpage=1
首先感谢回复的各位童鞋们，你们的建议很有用，我谢谢了，随后BB一一奉上，请注意查收！

目前本人双酶切已经彻底搞定，目的基因已经成功连接至载体上了，其实即便没有双酶切的图我也可以证明，见后面！
虽说一个简单的双酶切，没什么大不了的，确实没有什么大不了的，可是小问题往往能够反映出大智慧。。。相信一个谨慎的科研者在细节上肯定做的很好，正如最近一部比较火爆的电视剧《裸婚时代》：细节打败爱情，同样我这里想说的是：细节打败实验，如果你留心一下，看看你们实验室大家平时的做实验的习惯，你便可以看出来这个人的实验结果以及种种。。。我们实验室便是如此！

貌似扯得有些远了，其实想说的就是细节这个东西，尤其在科研上，很重要，非常重要！不要因为它小便觉得无所谓，便觉得小case，其实不然，小细节做好了，那么大事绝对成矣，只不过是迟早的事！

   其实酶切这个东西吧，看似简单，其实讲究很多。。。当然各种方法体系网上到处都是，包括公司的说明书上，这里我讲的是我的一些想法，还请各位指正！
就拿我这酶切验证重组载体吧，首先大体说说基本步骤：
1：双酶切载体，然后电泳看是否切开，如果没有切开，有可能是酶太少，也有可能是作用时间不够，切忌这个时候不能直接纯化然后去做连接，当然了可以做连接，但是成功率太低，浪费了东西不说，宝贵的时间也会浪费，所以一定要保证载体酶切的很干净，一点拖尾都不能有，然后纯化一下，当然了纯化是个浓缩的过程，比如我切50ul的体系，最后纯化的时候，终体积20-30ul即可，然后点样看看怎么样？这一块有一个小细节，就是点完样之后，可以把其它的纯化产物继续加到柱子上（现在大家基本都用试剂盒进行纯化吧，所以离心柱你懂的）！让它继续.....

2：酶切基因，其实这一步很简单，没有什么特殊要求，过夜酶切或者切它8 9 10个小时都行，随后进行纯化，纯化终体积见上面；最后点样看亮度。。。

3：连接：连接之前呢，先将载体和基因混合，热活化一下，即45度10min，然后加连接酶，buffer，ddH2O；体系不用我说了，大家应该很清楚了，我的原则呢，基因比载体多些。。。

4：转化：转化前45度活化10min，然后转化进大肠杆菌感受态。。。涂布于加抗生素的板子上，这一步因载体不同，抗性标记也不同，筛选标记也不同，常见的就是蓝白斑筛选了，涂布X-gal少不了，过夜培养，一般18-24h,之后长出来的很少有对的。。。挑几个疑似连接上的单克隆划线第二天验证。。。

5：验证：<1>PCR，可以作为初步筛选，用几个菌的裂解液当模板进行PCR，原来坛子上有人建议用快检的方法，也可以；PCR出来点样，有条带的那基本就对了；
                <2>能P出来的菌，提质粒，然后双酶切验证，验证对了基本你的克隆也就搞定了，下一步呢？可以测你想要的很多数据了。。。。因各种实验不同，以下就不赘述了。。。。

目前本人已经成功进行双酶切验证了，至于什么问题呢，大家如果感兴趣，见上面链接，直接上图
   
泳道1：marker
泳道2：载体digest
泳道3：gene digest
泳道4,5：重组载体 digest

我连接的这个片段500bp,虽说不大，可是做一个漂亮的双酶切，得到底下那条基因的条带还是比较难的，不过今天我重新提了质粒，质粒比较亮，然后多切了一些，这才勉强得到这张图，大家轻拍。。。呵呵！

所以大家如果以后连接小片段的话，尤其是小片段练到大载体上的话，提取的重组质粒一定要亮，质量一定要大，不然做双酶切验证那是何其的困难啊。。。我原先提取的重组载体不是很亮，然后双酶切，只有上面载体的条带，底下基因的那条木有啊，就是木有，你说郁闷不郁闷？所以切记：质粒一定要亮！
    当然了，酶切验证的体系呢，一般10ul就可以了，但是如果片段小的话，就像我这种情况，也可以切20ul体系的。。。

说了这么多，其实是本人的一些心得吧，拿来与大家分享，希望大家实验都顺利进行，每天像打鸡血一样进行实验，实验结果刷刷刷的往出蹦。。。呵呵呵！

[ Last edited by 天使托 on 2011-7-1 at 22:33 ]
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1楼 2011-07-01 22:26:29
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+5): 很好的补充！ 2011-07-05 19:56:59
西瓜(EPI+1): 差点漏了 2011-07-05 19:58:58
“3：连接：连接之前呢，先将载体和基因混合，热活化一下，即45度10min，然后加连接酶，buffer，ddH2O；体系不用我说了，大家应该很清楚了，我的原则呢，基因比载体多些。。。”

“基因比载体多些”是个很笼统的表述，因为《基因克隆》上一向是建议外源片段比载体多的。这个多主要表现在量上，摩尔数，而不是分子量。例如载体3KB而外源片段1KB，那么当摩尔数相同时，跑胶后两条带的亮度是不同的，载体带比外源带亮约三倍，但它们的摩尔数是相同的，所以能下定论说它们的量是相同的。为了增加连接时候载体和外源片段相互碰撞连接成功的几率，外源片段和载体的摩尔数比例应该大于1，我喜欢用3。


“4：转化：转化前45度活化10min，然后转化进大肠杆菌感受态。。。涂布于加抗生素的板子上，这一步因载体不同，抗性标记也不同，筛选标记也不同，常见的就是蓝白斑筛选了，涂布X-gal少不了，过夜培养，一般18-24h,之后长出来的很少有对的。。。挑几个疑似连接上的单克隆划线第二天验证。。。”

蓝白斑筛选的时候选用的抗生素是氨苄青霉素，抗性基因为一个可以将抗生素内环切开导致抗生素失效的酶，所以培养时间长之后，阳性克隆的周围抗生素浓度下降，原本被抗生素抑制的大肠杆菌就能长出来，构成假阳性。因为这种菌是后来才长出来的，所以会比阳性克隆长得小，又因为主要是在阳性克隆旁边长出来的，所以叫做卫星菌落。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
18楼2011-07-05 19:30:26
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