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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 电泳-分离胶凝得很慢！！
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lizhijiang

木虫 (著名写手)

[交流] 电泳-分离胶凝得很慢！！

各位虫友和老师，小虫是鲜嫩菜鸟，刚刚开始SDS-PAGE电泳。配制分离胶是10%的：三重水3.3ml，30%丙烯酰胺4ml，1.5mo/Ll Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 ml，10%SDS 0.1ml，10% 过硫酸铵 0.1ml，TEMED 0.004 ml。制胶时几个小时都不凝，这是什么原因？是不是可以这样考虑：
    1、30%丙烯酰胺中必须加甲叉双丙烯酰胺？好多资料显示需要加甲叉双丙烯酰胺，但我参照的是Bio-Rad提供的配制方法啊？郁闷。
    2、按照老师的指点说，加胶后，等小烧杯里的胶开始凝，玻璃板中的胶就应该凝了。可是为什么几个小时才开始凝？我试着增加了过硫酸铵和TEMED的用量，凝结的速度倒是很快，不知道这样影响结果不？
    3、即使胶凝结之后，我发现其硬度不够大，会给后期带来不便？怎么办？
    3、可不可以考虑换种分离胶的配方？希望虫友提供建议。
    希望论坛内的筒子们多给建议，万分感谢！
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1楼 2011-06-30 17:56:05
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lizhijiang

木虫 (著名写手)
我自己先占个位，静待高人指点！
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2楼2011-06-30 17:56:28
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hooroberts

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
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amisking(金币+2): 鼓励应助 2011-06-30 21:07:29
lizhijiang(金币+1): 谢谢，我也是要准备重新配一下试试的~ 2011-06-30 21:13:00
你没加甲叉双丙烯酰胺也能凝？
甲叉双丙烯酰胺可是交联剂，就是将丙烯酰胺连到一起的桥梁。
你参照的是Bio-Rad提供的配制方法，可是你看了它那30%丙烯酰胺得配法吗，里面应该有甲叉双丙烯酰胺的吧
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4楼2011-06-30 19:10:49
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caisanrenju

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
看天(金币+3): 鼓励回答 2011-06-30 23:10:02
lizhijiang(金币+1): 多谢你！ 2011-07-01 08:13:25
silicare(EPI+1): 2011-07-02 14:46:27
1。如楼上所说，甲叉双丙烯酰胺是必须加的，形成网络的重要组成
2。TEMED多加肯定凝的快，无甚影响，最怕加太多还没灌胶就凝了就不好了。
3。说实话，不知道你的没加甲叉的胶是怎么凝的！你说的多软没概念……
3。胶的配方是全部一样的，唯一的不同就是30%浓缩胶的用量不同，换配方的事情就不要想了
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5楼2011-06-30 22:45:09
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toxicpeach

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+2): 严重同意：以前我们实验室有人加入APS后不立即混匀就加入TEMED，之后也不混匀就加入胶板中，也会造成凝胶缓慢，或者凝胶不均匀的情况，楼主需要注意一下。 2011-07-01 08:14:01
引用回帖:
Originally posted by caisanrenju at 2011-06-30 22:45:09:
1。如楼上所说，甲叉双丙烯酰胺是必须加的，形成网络的重要组成
2。TEMED多加肯定凝的快，无甚影响，最怕加太多还没灌胶就凝了就不好了。
3。说实话，不知道你的没加甲叉的胶是怎么凝的！你说的多软没概念……
...

同意楼上的看法。
另外，还需要注意配胶的温度，一般夏天可以按这个比例加TEMED，冬天温度低就可以适当多加点。
一般我们不多加过硫酸铵APS。
你可以不用自己配制30%的丙烯酰胺，我们都是用的买的，很多公司有卖，比如上海生工，500ml要100多元吧，还很好用。不接触粉末丙烯酰胺，对我们来说可以减少受其毒害。
还需要说明的一点，以前我们实验室有人加入APS后不立即混匀就加入TEMED，之后也不混匀就加入胶板中，也会造成凝胶缓慢，或者凝胶不均匀的情况，楼主需要注意一下。

[ Last edited by toxicpeach on 2011-6-30 at 23:49 ]
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6楼2011-06-30 23:47:10
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zhaer

木虫 (小有名气)
★
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lizhijiang(金币+1): 应该没事。我做的是0.75mm。 2011-07-01 08:14:31
看看你的过硫酸铵是不是失效了，你要是跑1.0mm的胶，你加的量已经足够多了
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7楼2011-07-01 00:36:40
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lxfbsh2003

金虫 (小有名气)
新手学习学习
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8楼2011-07-01 09:05:47
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ma_zhe

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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silicare(金币+10): 处女帖，鼓励交流 2011-07-02 14:46:41
嗯，我第一次做的时候胶也是不凝，后来我才发现是那个TEMED的问题，我换成新买的TEMED，做胶就很快凝了。牛看看是不是你的试剂什么的过期了，或者你的加入量是不是有问题（最好让一个人看着你加，这样不会加错量）
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9楼2011-07-01 09:36:50
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lizhijiang

木虫 (著名写手)
凝了，凝了。好开心哟，谢谢大家。
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10楼2011-07-01 13:16:44
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xxzcf

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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silicare(金币+3, EPI+1): 谢谢参与 2011-07-02 14:47:27
引用回帖:
Originally posted by lizhijiang at 2011-06-30 10:56:05:
各位虫友和老师，小虫是鲜嫩菜鸟，刚刚开始SDS-PAGE电泳。配制分离胶是10%的：三重水3.3ml，30%丙烯酰胺4ml，1.5mo/Ll Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 ml，10%SDS 0.1ml，10% 过硫酸铵 0.1ml，TEMED 0.004 ml。制胶时几个 ...

交联反应需要时间，过快凝固不利于反应的充分发生和均匀的网格结构的形成。胶的治疗不是最好。通常如果精度要求比较高，应该将胶过夜，当然要包裹在水湿的纸巾中，防止脱水。

APS应新配，如果偷懒，可以配置后，分装，冷冻在-20度，每次取出一份使用，即用即弃。

最早的配方，还要抽真空呢。不要着急。
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11楼2011-07-01 19:00:08
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btx362237729

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
注意试剂别加漏了
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12楼2011-07-30 13:41:12
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zhouxj

至尊木虫 (文坛精英)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
还有可能是过硫酸铵获TEMED加少了，我上次就少加了一个零
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13楼2011-07-31 15:09:36
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tony0628

木虫 (小有名气)
1、30%丙烯酰胺中必须加甲叉双丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺是形成交联的桥梁。
    2、你可以重新配置新鲜的过硫酸铵，且过硫酸铵的量可以不用增加，仅增加TEMED的用量即可，对电泳结果影响不大。
    3、即使胶凝结之后，硬度不重要，本来就是柔软，只要不脆就行，太脆的话不利于后期操作。
    3、可以不用更改分离胶的配方，配方都是比例不一而已，胶不凝是试剂问题
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14楼2011-08-18 23:46:23
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啊哦小鑫123

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
请问各位，百分之30的浓缩胶是什么意思，百分之30指的是什么
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15楼2013-05-02 21:53:08
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bhj5603楼
2011-06-30 18:07   回复  
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