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电泳-分离胶凝得很慢！！
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各位虫友和老师，小虫是鲜嫩菜鸟，刚刚开始SDS-PAGE电泳。配制分离胶是10%的：三重水3.3ml，30%丙烯酰胺4ml，1.5mo/Ll Tris-HCl（pH 8.8） 2.5 ml，10%SDS 0.1ml，10% 过硫酸铵 0.1ml，TEMED 0.004 ml。制胶时几个小时都不凝，这是什么原因？是不是可以这样考虑： 1、30%丙烯酰胺中必须加甲叉双丙烯酰胺？好多资料显示需要加甲叉双丙烯酰胺，但我参照的是Bio-Rad提供的配制方法啊？郁闷。 2、按照老师的指点说，加胶后，等小烧杯里的胶开始凝，玻璃板中的胶就应该凝了。可是为什么几个小时才开始凝？我试着增加了过硫酸铵和TEMED的用量，凝结的速度倒是很快，不知道这样影响结果不？ 3、即使胶凝结之后，我发现其硬度不够大，会给后期带来不便？怎么办？ 3、可不可以考虑换种分离胶的配方？希望虫友提供建议。 希望论坛内的筒子们多给建议，万分感谢！ |
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2楼2011-06-30 17:56:28
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
看天(金币+3): 鼓励回答 2011-06-30 23:10:02
lizhijiang(金币+1): 多谢你！ 2011-07-01 08:13:25
silicare(EPI+1): 2011-07-02 14:46:27
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
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lizhijiang(金币+1): 多谢你！ 2011-07-01 08:13:25
silicare(EPI+1): 2011-07-02 14:46:27
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1。如楼上所说，甲叉双丙烯酰胺是必须加的，形成网络的重要组成 2。TEMED多加肯定凝的快，无甚影响，最怕加太多还没灌胶就凝了就不好了。 3。说实话，不知道你的没加甲叉的胶是怎么凝的！你说的多软没概念…… 3。胶的配方是全部一样的，唯一的不同就是30%浓缩胶的用量不同，换配方的事情就不要想了 |
5楼2011-06-30 22:45:09
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+2): 严重同意：以前我们实验室有人加入APS后不立即混匀就加入TEMED，之后也不混匀就加入胶板中，也会造成凝胶缓慢，或者凝胶不均匀的情况，楼主需要注意一下。 2011-07-01 08:14:01
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
lizhijiang(金币+2): 严重同意：以前我们实验室有人加入APS后不立即混匀就加入TEMED，之后也不混匀就加入胶板中，也会造成凝胶缓慢，或者凝胶不均匀的情况，楼主需要注意一下。 2011-07-01 08:14:01
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同意楼上的看法。 另外，还需要注意配胶的温度，一般夏天可以按这个比例加TEMED，冬天温度低就可以适当多加点。 一般我们不多加过硫酸铵APS。 你可以不用自己配制30%的丙烯酰胺，我们都是用的买的，很多公司有卖，比如上海生工，500ml要100多元吧，还很好用。不接触粉末丙烯酰胺，对我们来说可以减少受其毒害。 还需要说明的一点，以前我们实验室有人加入APS后不立即混匀就加入TEMED，之后也不混匀就加入胶板中，也会造成凝胶缓慢，或者凝胶不均匀的情况，楼主需要注意一下。 [ Last edited by toxicpeach on 2011-6-30 at 23:49 ] |
6楼2011-06-30 23:47:10
