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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于将一个基因放在EGFP-N1载体上的相关问题
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保护你的大树

新虫 (小有名气)

[求助] 关于将一个基因放在EGFP-N1载体上的相关问题

我现在有个基因在18t载体上，准备放在EGFP-N1在载体上面，我的基因在18T上市反着连的，最后我的基因和EGPF基因是共融表达的，启动子是CMV，我想问问做这个实验的具体步骤是什么，一般要注意些什么问题，谢谢哈。
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1楼 2011-06-21 16:53:18
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3, EPI+1): Good！ 2011-06-22 16:26:45
保护你的大树(金币+5): 2011-06-23 08:53:00
保护你的大树(金币+2): 2011-06-25 09:35:55
保护你的大树(金币+3): 2011-06-25 09:36:15
在18T上正反无所谓，如果已经带有酶切位点的直接酶切后和同样酶切的载体就是。如果没有酶切位点，就要设计引物PCR扩增，然后酶切与载体连接。
要注意的就是引物设计的时候保证读码框的正确性，还有就是PCR扩增用高保真的酶，并且还要测序证实。
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2楼2011-06-21 21:53:23
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gwbk

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 很活跃 2011-06-22 16:27:26
保护你的大树(金币+5): 2011-06-23 08:53:10
保护你的大树(金币+5): 2011-06-25 09:36:11
18t载体上正反没关系的，保证EGFP-N1质粒的方向正确就行了~~
帮楼主贴上EGFP-N1图谱~~
启动子CMV后面就是EGFP，设计酶切位点在MCS多克隆位点上，在CMV和EGFP之间。双酶切，保证基因的方向。

http://www.pkclab.org/PKC/vector/pEGFPN1.pdf

protocol二楼已经说得很明白了！照样做没问题的。
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3楼2011-06-21 22:29:31
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