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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于DNA提取的问题
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ybQuan

金虫 (著名写手)

[交流] 关于DNA提取的问题 已有6人参与

在提取昆虫DNA的时候，裂解液中加入一定的蛋白酶K，消化结束后加入醋酸甲沉淀杂质，然后用异丙醇沉淀DNA
我像我问的是：消化完后蛋白酶K要不要处理一下？有没有必要？
百度里有人说要95°灭火15min，蛋白酶K对DNA质量有什么影响?如果95°灭火，那做PCR的时候预变性时候不是就可以了吗？
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哥在江湖漂，很少不挨刀，不是愿意挨，是哥很无奈!
1楼 2011-06-21 15:09:50
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
★
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1949stone: 不停组织或样本 提取方法有点差异 2011-06-21 18:40:36
不用苯酚氯仿抽提的吗？没提过昆虫的，但是我们提链霉菌中DNA都是需要这个得
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在等待中涅槃重生
2楼2011-06-21 17:48:39
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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如果不灭活，蛋白酶K会影响后续的PCR反应（Taq酶也是蛋白），但对DNA应该没有影响。不过从保存的角度来说，东西越纯越好保存，还是去掉蛋白酶K的好。
从你说的方法来看，没有抽提的步骤，蛋白酶K可能除不尽，建议还是灭活更保险。
我们也是用蛋白酶K消化样品，用PCR仪做，最后是95度15分钟灭活，还是挺方便的。
PCR预变性一般用不了15分钟这么久吧，我们一般是5分钟甚至2分钟。
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3楼2011-06-21 21:38:00
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gwbk

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
都是用的试剂盒。用的都连原理都不清楚了~~~~
补习一下基础知识。帮楼主顶。
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4楼2011-06-21 22:34:58
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ybQuan

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-06-21 21:38:00:
如果不灭活，蛋白酶K会影响后续的PCR反应（Taq酶也是蛋白），但对DNA应该没有影响。不过从保存的角度来说，东西越纯越好保存，还是去掉蛋白酶K的好。
从你说的方法来看，没有抽提的步骤，蛋白酶K可能除不尽，建议 ...

你是说在PCR反应后延伸完了，再95°灭活吗？
醋酸钾沉淀杂质后上清再加无水乙醇就可以直接沉淀DNA的，你们用什么抽提？
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哥在江湖漂，很少不挨刀，不是愿意挨，是哥很无奈!
5楼2011-06-22 13:12:01
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by ybQuan at 2011-06-22 13:12:01:
你是说在PCR反应后延伸完了，再95°灭活吗？
醋酸钾沉淀杂质后上清再加无水乙醇就可以直接沉淀DNA的，你们用什么抽提？

我们是用PCR仪当水浴锅而已……95度灭活是你提取DNA的最后一步，灭活之后的DNA可以存起来也可以直接进行后续的PCR实验。

我们做的是线虫，蛋白酶K处理之后再灭活蛋白酶，就可以直接作为PCR模板了，跟你们的材料不一样，方法也不一样。

我们沉淀DNA的方法跟你的差不多，只不过没用在这里。样品量大的话，可以用苯酚氯仿抽提。不过方法是越简单越好，你可以按原方法提取之后进行PCR，如果有问题，再加一步95度15分钟灭活蛋白酶K就好了，之后再进行PCR。

不要把灭活这步当成预变性直接PCR，首先蛋白酶K没灭活之前会降解Taq酶，其次95度15分钟的条件对Taq酶的活性破坏也很大。
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6楼2011-06-22 15:17:12
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ybQuan

金虫 (著名写手)
恩谢谢你！
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哥在江湖漂，很少不挨刀，不是愿意挨，是哥很无奈!
7楼2011-06-23 10:13:02
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zboter

银虫 (正式写手)
★
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最好还是在pcr之前将蛋白酶K去除
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8楼2011-06-23 15:52:17
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ytflark
9楼2011-06-24 09:19:58
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林魂逸之

铜虫 (初入文坛)
★
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不需要的，酶的量很少，要酚：氯仿抽提可以去除。
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10楼2011-10-17 20:33:38
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