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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助 酶的功能基因中如何根据片段基因得到全段序列~急
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忧游鸟

铜虫 (小有名气)

[求助] 求助 酶的功能基因中如何根据片段基因得到全段序列~急

想得到一个纯菌种的酶的功能基因，现在已设计引物得到其片段基因，如何根据片段基因得到表达这个酶的全段基因。看到文献说有根据片段基因设计反向引物测序，反向测序是不是会测出很长的序列？还是直接做克隆？但是现在又没有全段的相关引物。还有说纯化这个酶直接氨基酸测定其N端氨基酸序列（好像有什么ABI Procise protein sequencer）也可以么？

重金悬赏求助啊

[ Last edited by 忧游鸟 on 2011-6-13 at 10:19 ]
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1楼 2011-06-13 10:18:01
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
忧游鸟(金币+5): 2011-06-13 11:13:21
西瓜(金币+5, EPI+1): 不愧是专家噢！ 2011-06-13 23:48:50
你说的两个方法都可以的。测定N端氨基酸序前要分离纯化，要求蛋白浓度较高，时间也长。你既然已经得到片段基因，也可以通过RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)技术得到全段基因。
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2楼2011-06-13 10:52:49
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friya0910

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
忧游鸟(金币+15): 5 2011-06-13 11:13:26
西瓜(金币+3): 欢迎新虫交流 2011-06-13 23:49:03
引用回帖:
Originally posted by 忧游鸟 at 2011-06-13 10:18:01:
想得到一个纯菌种的酶的功能基因，现在已设计引物得到其片段基因，如何根据片段基因得到表达这个酶的全段基因。看到文献说有根据片段基因设计反向引物测序，反向测序是不是会测出很长的序列？还是直接做克隆？但是 ...

根据片段基因设计引物做RACE，分别得到3’端和5’端序列，最后序列拼接得到全长ｃＤＮＡ序列。
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3楼2011-06-13 10:53:34
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忧游鸟

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lxj341401 at 2011-06-13 10:52:49:
你说的两个方法都可以的。测定N端氨基酸序前要分离纯化，要求蛋白浓度较高，时间也长。你既然已经得到片段基因，也可以通过RACE(rapid-amplification ofcDNA ends)技术得到全段基因。

这个RACE 是不是要提RNA再反转录得到cDNA啊，难度是不是很大？是不是也根据得到的片段基因上设计反向引物呢  具体不是学分子生物的 希望你能详细解说一下 谢谢
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4楼2011-06-13 11:12:06
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忧游鸟

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by friya0910 at 2011-06-13 10:53:34:
根据片段基因设计引物做RACE，分别得到3’端和5’端序列，最后序列拼接得到全长ｃＤＮＡ序列。

设计引物也是反向设计引物么？
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5楼2011-06-13 11:15:36
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): Good！楼主可以先搜索下RACE基础知识来学习先。 2011-06-13 23:49:41
引用回帖:
Originally posted by 忧游鸟 at 2011-06-13 11:15:36:
设计引物也是反向设计引物么？

一端引物是你得到片段测序出来的，另外一端引物是接头引物或者PolyA引物，具体要看。先去把RACE的原理和流程看看，然后整理出个思路来。
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6楼2011-06-13 11:35:54
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wolfebst

至尊木虫 (职业作家)
直接在DNA层面做就可以了
根据得到的片段设计引物，做个基因组步移就行了TAIL-PCR
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7楼2011-06-16 23:37:42
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quietorange

铁虫 (小有名气)
基于PCR的genome walking，原理跟上面有同学说的方法类似，大致说来就是提总DNA用平末端酶酶切，然后和人工合成的接头DNA连接作为模板，根据你已经克隆到的那一段设计一端的引物，根据接头设计另一端的引物，PCR。缺点是不一定一次能获得全长。
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8楼2011-06-17 01:16:44
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