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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » [求助]高保真酶扩不出来
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30937747

木虫 (小有名气)

[求助] [求助]高保真酶扩不出来

我提取RNA做反转录得到cDNA,以cDNA为模板做PCR,用普通taq酶扩出来的片段很亮,而且专一性很好,但是换高保真酶都扩不出来,换了两种酶,温度梯度和浓度梯度都做了,延伸的时间也增长了一倍.但是就是没有结果,请问有什么好的建议吗?
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我依旧会努力.
1楼 2011-06-05 16:46:48
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
rainwander(金币+3): 鼓励交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金币+4): 非常感谢,但是有一个问题是,我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好? 2011-06-07 07:20:18
楼主是想做一些基因下游实验吧，Taq酶的活性确实要比高保真酶的活性强，这是公认的。鉴于这种情况，给你两种可供选择的Protocol：
1，若果你的目的片段不大，1-2.5kb，可以先用好一点的Taq酶扩增了，上质粒，测序没有突变后，然后再用pfu酶或Phusion等高保真酶进行亚克隆；
2、如果楼主觉得上面这个方案麻烦，你可以在你的高保真酶中加入少量的高质量的Taq酶，记住是质量好的Taq酶，然后参照高保真酶的反应条件进行扩增，也许这可以解决你的问题
Bless you！
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2楼2011-06-05 22:11:54
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phyllislhy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
30937747(金币+2): cDNA能像双链DNA那样纯化么? 2011-06-07 12:51:47
rainwander(金币+1): 鼓励交流 2011-06-07 22:40:31
高保真酶一般对DNA质量要求较高，因此提DNA除蛋白时不要嫌麻烦，多抽提几次
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3楼2011-06-07 12:44:34
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金币+2): 是昆虫的,我搜过了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
"我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好?"
你的序列是未知的是指不知道是什么微生物，还是不知道这个“微生物分离株”的特有序列，如果是前者，你可以用先用一般的taq酶（可以找promega或invitrogen公司的不错）进行随机扩增，在根据获得的序列设计特异性引物去扩增，这时候就可以选用高保真酶（前面提到的几个公司都有，但价钱比较贵），不过都是pfu酶及其衍生系列。如果知道是什么微生物，就可以根据该属的微生物已上传的序列的保守区设计引物，进行扩增。后面这种情况会顺利很多。
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4楼2011-06-07 21:18:17
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hnsdly

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

30937747(金币+1): 都试过了.谢谢 2011-06-08 23:10:06
高保真的酶有时候的确不太容易扩增出目的片段。可以试试降低退火温度、加大酶量
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5楼2011-06-08 12:57:50
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

race做的会麻烦些，建议还是充分分析同属或同科的物种序列，一般在头或尾都有一段非常保守的序列，根据这些序列设计引物，在根据内部区域相对保守的地方设计兼并引物，先用质量好的Taq酶扩增，获得序列后在设计特异性引物进行扩增，个人感觉这样不做RACE会来的方便可行些
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6楼2011-06-09 10:32:29
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daqwu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

30937747(金币+1): 3ks 2011-06-10 16:24:57
可以试试东洋坊的KOD-plus酶，保真性高，效率也还行。
另外加3-5%的DMSO也可以提高扩增效率.
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7楼2011-06-09 12:23:20
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glory_star

新虫 (初入文坛)
你看看你的BUFFER是不是完全的化了之后再加入的，我曾经就没化完就加了，结果也没有结果，高保真的酶对离子浓度的要求挺高的……
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8楼2011-07-01 14:15:59
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青菜小虫

银虫 (著名写手)

风居住的街道

我也是提RNA反转录后进行PCR的，我就是提RNA没用试剂盒，但我RT-PCR是用的北京全式金的，这个盒子特别好，我建议你用这个，我之前用过宝生物TAKARA的，太贵也不好用。我的基因全长15186bp，分了12个片段，现在片段都已经得到也连接到PMD18-T上了。
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生命即这般无尽变数，辗转来去皆苛求不得
9楼2011-07-01 14:53:11
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txy8469393

木虫 (小有名气)

拿着扫把的研究僧
taq加pfu，9比1。
如果片段不长，直接taq就行了，突变率不会太高的，多送几个测序就是了。建议PCR做15-20个循环就可以了，最好不要超过25个。
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找我请打110,你别看我拿着扫把,其实我是弹吉他的!
10楼2011-07-10 08:08:51
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