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30937747

木虫 (小有名气)

[求助] [求助]高保真酶扩不出来

我提取RNA做反转录得到cDNA,以cDNA为模板做PCR,用普通taq酶扩出来的片段很亮,而且专一性很好,但是换高保真酶都扩不出来,换了两种酶,温度梯度和浓度梯度都做了,延伸的时间也增长了一倍.但是就是没有结果,请问有什么好的建议吗?
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我依旧会努力.
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
rainwander(金币+3): 鼓励交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金币+4): 非常感谢,但是有一个问题是,我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好? 2011-06-07 07:20:18
楼主是想做一些基因下游实验吧,Taq酶的活性确实要比高保真酶的活性强,这是公认的。鉴于这种情况,给你两种可供选择的Protocol:
1,若果你的目的片段不大,1-2.5kb,可以先用好一点的Taq酶扩增了,上质粒,测序没有突变后,然后再用pfu酶或Phusion等高保真酶进行亚克隆;
2、如果楼主觉得上面这个方案麻烦,你可以在你的高保真酶中加入少量的高质量的Taq酶,记住是质量好的Taq酶,然后参照高保真酶的反应条件进行扩增,也许这可以解决你的问题
Bless you!
2楼2011-06-05 22:11:54
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金币+2): 是昆虫的,我搜过了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
"我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好?"
你的序列是未知的是指不知道是什么微生物,还是不知道这个“微生物分离株”的特有序列,如果是前者,你可以用先用一般的taq酶(可以找promega或invitrogen公司的不错)进行随机扩增,在根据获得的序列设计特异性引物去扩增,这时候就可以选用高保真酶(前面提到的几个公司都有,但价钱比较贵),不过都是pfu酶及其衍生系列。如果知道是什么微生物,就可以根据该属的微生物已上传的序列的保守区设计引物,进行扩增。后面这种情况会顺利很多。
4楼2011-06-07 21:18:17
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cellline

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

race做的会麻烦些,建议还是充分分析同属或同科的物种序列,一般在头或尾都有一段非常保守的序列,根据这些序列设计引物,在根据内部区域相对保守的地方设计兼并引物,先用质量好的Taq酶扩增,获得序列后在设计特异性引物进行扩增,个人感觉这样不做RACE会来的方便可行些
6楼2011-06-09 10:32:29
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cellline

木虫 (正式写手)

引用回帖:
13楼: Originally posted by wangzhangwan at 2013-06-17 19:50:14
我想问一下,高保真和Taq酶混合到一起,混合的比例是多少?...

最开始可以参照2:1的比例试试,这要看你前面的预实验中扩增效果和片段大小,如果扩增效果不好,可适当增加Taq酶的比例到1:1-1:2。
14楼2013-06-17 21:40:08
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