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30937747木虫 (小有名气)
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[求助]
[求助]高保真酶扩不出来
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| 我提取RNA做反转录得到cDNA,以cDNA为模板做PCR,用普通taq酶扩出来的片段很亮,而且专一性很好,但是换高保真酶都扩不出来,换了两种酶,温度梯度和浓度梯度都做了,延伸的时间也增长了一倍.但是就是没有结果,请问有什么好的建议吗? |
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青菜小虫
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9楼2011-07-01 14:53:11
【答案】应助回帖
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rainwander(金币+3): 鼓励交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金币+4): 非常感谢,但是有一个问题是,我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好? 2011-06-07 07:20:18
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30937747(金币+4): 非常感谢,但是有一个问题是,我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好? 2011-06-07 07:20:18
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楼主是想做一些基因下游实验吧，Taq酶的活性确实要比高保真酶的活性强，这是公认的。鉴于这种情况，给你两种可供选择的Protocol： 1，若果你的目的片段不大，1-2.5kb，可以先用好一点的Taq酶扩增了，上质粒，测序没有突变后，然后再用pfu酶或Phusion等高保真酶进行亚克隆； 2、如果楼主觉得上面这个方案麻烦，你可以在你的高保真酶中加入少量的高质量的Taq酶，记住是质量好的Taq酶，然后参照高保真酶的反应条件进行扩增，也许这可以解决你的问题 Bless you！ |
2楼2011-06-05 22:11:54
phyllislhy
木虫 (正式写手)
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3楼2011-06-07 12:44:34
【答案】应助回帖
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金币+2): 是昆虫的,我搜过了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
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30937747(金币+2): 是昆虫的,我搜过了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
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"我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好?" 你的序列是未知的是指不知道是什么微生物，还是不知道这个“微生物分离株”的特有序列，如果是前者，你可以用先用一般的taq酶（可以找promega或invitrogen公司的不错）进行随机扩增，在根据获得的序列设计特异性引物去扩增，这时候就可以选用高保真酶（前面提到的几个公司都有，但价钱比较贵），不过都是pfu酶及其衍生系列。如果知道是什么微生物，就可以根据该属的微生物已上传的序列的保守区设计引物，进行扩增。后面这种情况会顺利很多。 |
4楼2011-06-07 21:18:17
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