| 查看: 3164 | 回复: 15 | ||
| 本帖产生 2 个 MicEPI ，点击这里进行查看 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
30937747木虫 (小有名气)
|
[求助]
[求助]高保真酶扩不出来
|
|
| 我提取RNA做反转录得到cDNA,以cDNA为模板做PCR,用普通taq酶扩出来的片段很亮,而且专一性很好,但是换高保真酶都扩不出来,换了两种酶,温度梯度和浓度梯度都做了,延伸的时间也增长了一倍.但是就是没有结果,请问有什么好的建议吗? |
回复此楼» 猜你喜欢
焦虑
已经有8人回复
-
308求调剂
已经有4人回复
-
NSFC申报书里申请人简历中代表性论著还需要在申报书最后的附件里面再上传一遍吗
已经有14人回复
-
材料与化工一志愿南昌大学327求调剂推荐
已经有6人回复
-
化学调剂0703
已经有7人回复
-
327求调剂
已经有11人回复
-
调剂
已经有8人回复
-
梁成伟老师课题组欢迎你的加入
已经有7人回复
-
伙伴们，祝我生日快乐吧
已经有24人回复
-
中科院材料273求调剂
已经有3人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 高保真酶PCR
已经有6人回复
- puf酶与普通Taq酶混用PCR问题
已经有22人回复
- 【求助/交流】关于pfu酶PCR
已经有8人回复
txy8469393
木虫 (小有名气)
拿着扫把的研究僧
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 3477.9
- 散金: 58
- 红花: 16
- 帖子: 258
- 在线: 117.2小时
- 虫号: 217565
- 注册: 2006-03-12
- 专业: 病原细菌与放线菌生物学
10楼2011-07-10 08:08:51
【答案】应助回帖
★ ★ ★
rainwander(金币+3): 鼓励交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金币+4): 非常感谢,但是有一个问题是,我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好? 2011-06-07 07:20:18
rainwander(金币+3): 鼓励交流 2011-06-05 23:05:25
rainwander(EPI+1): 2011-06-05 23:05:29
30937747(金币+4): 非常感谢,但是有一个问题是,我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好? 2011-06-07 07:20:18
|
楼主是想做一些基因下游实验吧，Taq酶的活性确实要比高保真酶的活性强，这是公认的。鉴于这种情况，给你两种可供选择的Protocol： 1，若果你的目的片段不大，1-2.5kb，可以先用好一点的Taq酶扩增了，上质粒，测序没有突变后，然后再用pfu酶或Phusion等高保真酶进行亚克隆； 2、如果楼主觉得上面这个方案麻烦，你可以在你的高保真酶中加入少量的高质量的Taq酶，记住是质量好的Taq酶，然后参照高保真酶的反应条件进行扩增，也许这可以解决你的问题 Bless you！ |
2楼2011-06-05 22:11:54
phyllislhy
木虫 (正式写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 2070.6
- 红花: 2
- 帖子: 411
- 在线: 64.3小时
- 虫号: 105582
- 注册: 2005-11-16
- 性别: MM
- 专业: 微生物资源与分类学
3楼2011-06-07 12:44:34
【答案】应助回帖
★ ★
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金币+2): 是昆虫的,我搜过了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
rainwander(金币+2): 鼓励交流 2011-06-07 22:40:42
rainwander(EPI+1): 2011-06-07 22:40:49
30937747(金币+2): 是昆虫的,我搜过了.同源性都很低.所以也找不到保守序列.是需要做RACE的,所以序列基本上等于未知~ 2011-06-08 23:09:53
|
"我的序列是未知的,所以才做反转录,所以我无法确定是否突变.才必须要用高保真酶.请问哪种taq酶比较好?" 你的序列是未知的是指不知道是什么微生物，还是不知道这个“微生物分离株”的特有序列，如果是前者，你可以用先用一般的taq酶（可以找promega或invitrogen公司的不错）进行随机扩增，在根据获得的序列设计特异性引物去扩增，这时候就可以选用高保真酶（前面提到的几个公司都有，但价钱比较贵），不过都是pfu酶及其衍生系列。如果知道是什么微生物，就可以根据该属的微生物已上传的序列的保守区设计引物，进行扩增。后面这种情况会顺利很多。 |
4楼2011-06-07 21:18:17
