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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 质粒提取
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yesucao

木虫 (正式写手)

[求助] 质粒提取

不知道为什么最近两次提取的质粒老是如图这样子，条带模糊、弥散。挑取的是转化子
摇菌、使用溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和醋酸铵和氯化锂提取的，前几天刚提过其他的质粒，能提好，不存在试剂的问题（不过挑取转化子时没提好，之后甘油管活化再挑取的单菌落才提好）；每次都是本人亲自动手，应该也不存在操作问题吧！
还请各位大虾帮忙分析一下，中间一个是Marker（4微升点样），其他均为质粒（5微升点样）
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1楼 2011-06-01 11:02:24
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healerly

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★
yesucao(金币+3): 实验室的溶液2是高浓度的，放在室温有一段时间了，对于保存时间和问题之前没多大考虑 2011-06-01 17:49:55
yesucao(金币+7): 2011-06-01 17:50:15
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-01 18:26:53
本帖内容被屏蔽
2楼2011-06-01 13:32:05
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sxq大嘴

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 欢迎交流。为什么呢？ 2011-06-01 18:27:04
溶液2的问题，要不就是有DNA酶污染
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3楼2011-06-01 14:16:54
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by healerly at 2011-06-01 13:32:05:
1.可能是溶液二的问题，因为碱裂解法中二溶液，一般是现配现用，也可以用高浓度稀释，不知道你NaOH是怎么保存的？
2.如果不是溶液的问题的话，那就是电泳的问题了，看看是不是电压太大了~~

溶液2 是2%的SDS和0.4M的氢氧化钠，用的时候分别加100微升，均是室温保存；
每次跑电压一般是在90-100V之间
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4楼2011-06-01 17:40:54
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healerly

禁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
amisking(金币+3, EPI+1): 鼓励应助 2011-06-01 21:04:26
引用回帖:
Originally posted by yesucao at 2011-06-01 17:40:54:
溶液2 是2%的SDS和0.4M的氢氧化钠，用的时候分别加100微升，均是室温保存；
每次跑电压一般是在90-100V之间

1.NaOH建议还是4度保存吧，还有就是如果在提质粒的时候如果加完二溶液冰浴5-10分钟后还没有粘稠的话，就没必要做下去了。
2.看看电流吧，会不会电泳液时间太长了。
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heal the world！！！
5楼2011-06-01 18:29:24
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★
1949stone(金币+1): 的确有疑问 2011-06-04 11:14:27
什么样的ladder，什么样的转化子，多大的质粒，提取质粒的详细步骤是怎样的？
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2011-06-01 18:49:38
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
★ ★
dhd997(金币+2): 一步步的解决 2011-06-02 09:07:36
Ladder跑得那么好，说明你的电压和电流可能没问题。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
7楼2011-06-02 01:49:57
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by healerly at 2011-06-01 18:29:24:
1.NaOH建议还是4度保存吧，还有就是如果在提质粒的时候如果加完二溶液冰浴5-10分钟后还没有粘稠的话，就没必要做下去了。
2.看看电流吧，会不会电泳液时间太长了。

1、一般加完溶液2，颠倒几下就有粘稠的了，然后放置了2min
2、电流是在90mA, 电泳时间在40min左右的样子
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8楼2011-06-02 10:52:57
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yesucao

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 冼亮淀粉酶 at 2011-06-01 18:49:38:
什么样的ladder，什么样的转化子，多大的质粒，提取质粒的详细步骤是怎样的？

15000bp的Marker，转化子是pHT304
具体步骤：
1．将1.5ml菌液以13000g离心30秒（所有离心均在室温下进行），弃去上清液。
2．加入100μl溶液Ⅰ，振荡使菌体充分分散，室温放置2min
3．加入200μl新配置的溶液Ⅱ，轻轻将离心管颠倒数次，混匀内容物，室温放置2min
4．加150μl冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻将离心管颠倒数次，直至白色沉淀充分形成，冰浴3min后，以13000g离心3min.
5．小心转移上清液，并加入两倍体积95%乙醇，室温放置5min后，以13000g离心4 min,尽弃上清。
6．用200μlTE或无菌双蒸水溶解沉淀物后，加入150μl溶液Ⅳ（醋酸铵）和150μl溶液Ⅴ（氯化锂），充分混匀后冰浴3min，然后以13000g离心3min
7．小心转移上清，并加入2倍体积95%乙醇，室温放置3min后以13000g离心5min
8．弃尽上清，沉淀用70%无水乙醇洗涤两次后，倒尽乙醇，用真空浓缩仪抽干3min或自然晾干
9．用20μl无菌双蒸水溶解DNA沉淀，同时加入1μlRNase(10μg/μl),37℃水浴10min后于-20℃保存备用。
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9楼2011-06-02 10:57:01
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diduqiong

木虫 (初入文坛)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 眼神很犀利哦 2011-06-03 18:32:50
你加溶液二的时候轻轻颠倒啊，看看点样孔那里那么亮的带，染色体都被你摇断了啊
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狗屎养鲜花
10楼2011-06-02 14:31:16
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