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yesucao木虫 (正式写手)
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质粒提取
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不知道为什么最近两次提取的质粒老是如图这样子，条带模糊、弥散。挑取的是转化子 摇菌、使用溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ和醋酸铵和氯化锂提取的，前几天刚提过其他的质粒，能提好，不存在试剂的问题（不过挑取转化子时没提好，之后甘油管活化再挑取的单菌落才提好）；每次都是本人亲自动手，应该也不存在操作问题吧！ 还请各位大虾帮忙分析一下，中间一个是Marker（4微升点样），其他均为质粒（5微升点样）  |
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 【分子生物】EPI帖 |
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yesucao(金币+3): 实验室的溶液2是高浓度的，放在室温有一段时间了，对于保存时间和问题之前没多大考虑 2011-06-01 17:49:55
yesucao(金币+7): 2011-06-01 17:50:15
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-01 18:26:53
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2楼2011-06-01 13:32:05
3楼2011-06-01 14:16:54
yesucao
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4楼2011-06-01 17:40:54
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6楼2011-06-01 18:49:38
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7楼2011-06-02 01:49:57
yesucao
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8楼2011-06-02 10:52:57
yesucao
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15000bp的Marker，转化子是pHT304 具体步骤： 1．将1.5ml菌液以13000g离心30秒（所有离心均在室温下进行），弃去上清液。 2．加入100μl溶液Ⅰ，振荡使菌体充分分散，室温放置2min 3．加入200μl新配置的溶液Ⅱ，轻轻将离心管颠倒数次，混匀内容物，室温放置2min 4．加150μl冰预冷的溶液Ⅲ，轻轻将离心管颠倒数次，直至白色沉淀充分形成，冰浴3min后，以13000g离心3min. 5．小心转移上清液，并加入两倍体积95%乙醇，室温放置5min后，以13000g离心4 min,尽弃上清。 6．用200μlTE或无菌双蒸水溶解沉淀物后，加入150μl溶液Ⅳ（醋酸铵）和150μl溶液Ⅴ（氯化锂），充分混匀后冰浴3min，然后以13000g离心3min 7．小心转移上清，并加入2倍体积95%乙醇，室温放置3min后以13000g离心5min 8．弃尽上清，沉淀用70%无水乙醇洗涤两次后，倒尽乙醇，用真空浓缩仪抽干3min或自然晾干 9．用20μl无菌双蒸水溶解DNA沉淀，同时加入1μlRNase(10μg/μl),37℃水浴10min后于-20℃保存备用。 |
9楼2011-06-02 10:57:01
diduqiong
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