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seamuse

木虫 (著名写手)

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[求助] 转基因植株DNA PCR检测要不就不出带，要不就连水和阴性对照都出带？？？急急急！！！

我最近在检测转基因植株T1和T4代DNA,用CTAB法小提的，DNA原液的浓度是3000ng/ul左右，（见附件）稀释20倍后取2微升做的模板，引物1（有师姐已经用过了，效果还挺好的）扩增的片段大小在950bp左右，25微升体系如下
buffer 2.5，
dntp 2,
引物各1微升，
taq酶（5U）0.2微升
模板 2 微升
水 16.3
扩增程序如下95 5min ,94 50s,56 40s,72 90s,35循环，72,10min.
但是扩增结果总是不好，开始是只有很少的几个样出带，（应该大部分都是阳性植株才对，因为上一代都是检测过的，）其中也包括阳性的质粒对照，见图1，
我以为是引物合成不好，就重新合成了但是结果还是不好，后来又设计了几对引物但结果还是不好，要不就是连水和转基因母本（阴性对照）都出带，要不就是还是和之前一样都不出带，从第2张图开始就是另外的引物跑的了，只要出带的都在目的带的大小左右
图1
上面的一排都没出带，就只有下排3个出带的，最后一个是阳性对照

图2
水也出带了，是什么原因啊，换了水和引物后又都不出带了，而且本来同样的体系这一次水没带，下一次又有了

图3也是同样的情况，水和阴性对照（bfck）都出带了

图4pcr，有类似于弥散的现象，还有的就是最下面很亮类似于引物二聚体，像彗星似的带，这张的图放反了，MAKER也表示反了

图5，前面的都有带，但很模糊，后面的都没有了而且拖尾现象严重，

[ Last edited by seamuse on 2011-5-18 at 18:14 ]

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