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passingby

铜虫 (小有名气)

[交流] 高手帮帮我 已有6人参与

我刚开始学习做分子生物学实验，好多方面还不很懂，这张图是我做的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物拍的照，我基本上都是按照操作步骤做下来的，结果就只有两个孔能看到点东西，而且还不清晰，另外我发现自己做的胶没别人做的好看，白的白，黑的黑，还有脏东西，我之前已经把锥形瓶什么的都洗干净了，可还是这样，为什么呢

高手能不能给我点建议，谢谢啦
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不能再走一步算一步了，我要计划好每一步该怎么走，起码要做到心中有数！
1楼 2011-05-12 15:37:13
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
★
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你这些孔里点的都是什么样 什么都不知道也不好分析啊~瓶子刷干净了是不是TAE什么的不干净或者制胶的板不干净啊
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2楼2011-05-12 15:44:59
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★
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西瓜(金币+2, EPI+1): Ok~ 2011-05-12 16:04:30
1: PCR这个东西其实说实话，做得多了也就很随意了，但是对于初学者来说还是要注意各个操作细节，没有做出来没关系，可以改变体系，改变温度，延伸时间继续做。

2：你的胶确实配的不太好，有可能是琼脂糖溶解的不彻底，核算染料没有完全混合到缓冲液中，还有缓冲液是不是新配置的呢？

出现问题了，就要考虑到各个环节是不是出现了什么问题，然后找到问题，一一解决，那么最终一张完美的PCR图就会呈现到你的面前！

加油！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
3楼2011-05-12 15:48:54
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passingby

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by passingby at 2011-05-12 15:37:13:
我刚开始学习做分子生物学实验，好多方面还不很懂，这张图是我做的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物拍的照，我基本上都是按照操作步骤做下来的，结果就只有两个孔能看到点东西，而且还不清晰，另外我发现自己做的胶没别 ...

这是我做的一个正交PCR优化，看看PCR结果有哪些差异的，点的就是PCR产物，结果好多根本没有带，除了Marker其它都不清晰，会不会是DNA提的不好的缘故呢，做了好几块胶差不多都是这样，上半部分发白，和EB有关吗？这胶做的让我很纠结
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不能再走一步算一步了，我要计划好每一步该怎么走，起码要做到心中有数！
4楼2011-05-12 16:11:47
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passingby

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-12 15:48:54:
1: PCR这个东西其实说实话，做得多了也就很随意了，但是对于初学者来说还是要注意各个操作细节，没有做出来没关系，可以改变体系，改变温度，延伸时间继续做。

2：你的胶确实配的不太好，有可能是琼脂糖溶解的 ...

嗯，谢谢你的建议，很中肯，看来我的任务还很多
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不能再走一步算一步了，我要计划好每一步该怎么走，起码要做到心中有数！
5楼2011-05-12 16:13:10
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passingby

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by bbwalkman at 2011-05-12 15:44:59:
你这些孔里点的都是什么样 什么都不知道也不好分析啊~瓶子刷干净了是不是TAE什么的不干净或者制胶的板不干净啊

这是我做的一个正交PCR优化，看看PCR结果有哪些差异的，点的就是PCR产物，结果好多根本没有带，除了Marker其它都不清晰，会不会是DNA提的不好的缘故呢，做了好几块胶差不多都是这样，上半部分发白，和EB有关吗？这胶做的让我很纠结
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不能再走一步算一步了，我要计划好每一步该怎么走，起码要做到心中有数！
6楼2011-05-12 16:14:06
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+5, EPI+1): 辛苦，一并奖励 2011-05-13 09:13:27
1.在我看来，你这个是PCR没有扩增出产物。你标出来的两条带很小且模糊，很可能是引物二聚体。PCR扩增不出来的原因实在太多了，不好说。
2.Maker跑得很好，条带亮，没有拖尾（没有降解，电泳中没有污染DNA酶），泳道也端端正正，说明做胶（琼脂糖、EB、缓冲液等等）、上样操作、电泳、拍照都没有大问题。当然如果偏巧就是PCR产物那几个孔破了或者没上到样品，或者PCR产物降解什么的，我就没话说了……
3.你说胶不好，我不认为，我觉得挺好的：
（1）“白的白，黑的黑”：【1】你这个胶应该是配胶时就加了EB吧。电泳的时候，EB会从正极向负极移动（与DNA反向）。你看你的胶，下半部是黑的，上半部是白的，那是因为EB都移到上面去了，所以上半部背景会更亮。【2】你标出来的那两条带上面，有一条黑带，应该是溴酚蓝（电泳时看到的那条蓝色的线）。【3】maker最上那条带的位置，有一道黑线，这个我就不懂了。可能也是上样缓冲液的指示剂（类似溴酚蓝）。你跑电泳时看到这个位置有颜色吗？
（2）“脏东西”：【1】可能是加EB加晚了，此时琼脂糖快凝固了，EB分散不开。加EB后记得摇匀。【2】我更倾向这个原因：机器不干净。就是说你拍照的仪器，放胶的那个地方可能脏了。这个很常见的。我们一般是铺层保鲜膜，再把胶放上去拍照，觉得脏了就换一张保鲜膜。
（3）“锥形瓶洗干净”：我们跑胶，锥形瓶、梳子、模具这些几乎不洗的，没问题滴！

你说同学的好，不如也贴上来比较比较吧。

啰嗦了一堆，观点就一个：电泳很好，PCR可能有问题。
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7楼2011-05-12 16:28:58
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
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引用回帖:
Originally posted by passingby at 2011-05-12 16:11:47:
这是我做的一个正交PCR优化，看看PCR结果有哪些差异的，点的就是PCR产物，结果好多根本没有带，除了Marker其它都不清晰，会不会是DNA提的不好的缘故呢，做了好几块胶差不多都是这样，上半部分发白，和EB有关吗 ...

你先确认下提的DNA模板ok了没，再做PCR吧。

话说，把标题改为具体问题吧，这样关注的人才多。提问也要讲方法的哦。
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8楼2011-05-12 16:35:49
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bbwalkman

木虫 (小有名气)
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dhd997(金币+3): 欢迎交流 2011-05-13 09:13:42
你要P的目的片段是多大啊 Maker是多少bp的啊 感觉你的带不像是产物啊 有点像引物形成的dimer啊 亮度不一样可能是EB的原因~~你看看吧 我觉得你是没p出来 看看DNA模板和引物什么的 还有退火温度什么的 好好做做吧 肯定能成功的
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9楼2011-05-12 16:59:48
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yuliansheng

金虫 (小有名气)
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西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-05-12 21:28:38
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Originally posted by passingby at 2011-05-12 15:37:13:
我刚开始学习做分子生物学实验，好多方面还不很懂，这张图是我做的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物拍的照，我基本上都是按照操作步骤做下来的，结果就只有两个孔能看到点东西，而且还不清晰，另外我发现自己做的胶没别 ...

前面如果步骤都做得没错的话，有可能向楼上说的，做的胶不干净，也有可能跟最后的拍相技术有关。我刚开始学这东西时，也总是感觉相片出来不如别人做的好看，你试着调调机器的对比度、亮度什么的。再一个就是，自己的实验操作技术，虽说都是和别人一样，一步步做下来的，但最后结果就是和别人不一样，这还是说明自己的技术不过关，没事，多练练就好，我刚开始时也和你现在一样，连跑个胶都跑不出图像来，后来慢慢练练就好了。实验这个东西就是这样，又是错都不知道自己错在哪，对也不知道自己对在哪，操作熟练了就好了。
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学习....
10楼2011-05-12 18:37:57
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