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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RNA提取问题
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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] RNA提取问题

从细胞中提取ＲＮＡ，在加入Trizol后，混匀，室温放置10分钟，目的是RNA和蛋白分离，然后加入氯仿，促使RNA进入水相中，12000转，离心10分钟，取上清转移至新管，加入等体积的异丙醇，目的为了使ＲＮＡ沉淀，可是离心后没有沉淀，我不知道还用不用继续往下做？出现这种情况的原因在哪儿？请各位指教
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1楼 2011-04-28 23:46:02
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:52:29
可能是肉眼看不见吧，不能完全确定没有，最好还是往下做做看
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2楼2011-04-29 08:23:02
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:52:34
有可能是氯仿残留，多加点异丙醇试一试
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3楼2011-04-29 08:31:33
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gagalady

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+2): 2011-04-29 13:52:41
加完TRIzol后，要立即把细胞裂解，这一步要求快，放十分钟没必要，5分钟就ok；
加氯仿之后，要用力震荡，（用最大的力气），这步是也要放置一会的吧
此步之后高速4度离心15分钟吧
之后就是把上清洗出来（1ml TRIzol 的话 没必要吸出很多 300微升 就很多了，吸多了 不保险呀）
异丙醇我都加 500微升  加进去要枪头混匀，之后静置10min，低温不利于沉淀哦，室温，之后4度离心，沉淀很少的，不过对着光 用肉眼看 还是很能看清楚的。
多提取几次 就利索了
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4楼2011-04-29 08:53:18
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
具体点
1. 初始细胞量多少？
2. 氯仿量？
3. 取上清的量？
4. 异丙醇的量？

如果上述都正常，可在异丙醇沉淀的时候加点glycogen，提完之后测下RNA的量
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生活是美好的
5楼2011-04-29 08:54:53
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:54:47
加异丙醇时还需加入高盐溶液，才能沉淀。
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6楼2011-04-29 09:39:36
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花的泪

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:55:08
其实核酸本来就是无色的絮状物，楼主想看到的白色沉淀是变性的蛋白。很可能你抽出来的RNA量很少。
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7楼2011-04-29 13:15:56
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by lixg at 2011-04-29 09:39:36:
加异丙醇时还需加入高盐溶液，才能沉淀。

买过来的试剂中没有要求加入盐溶液，所以就没有加
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8楼2011-04-29 13:54:14
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by nuoyaeva at 2011-04-29 08:54:53:
具体点
1. 初始细胞量多少？
2. 氯仿量？
3. 取上清的量？
4. 异丙醇的量？

如果上述都正常，可在异丙醇沉淀的时候加点glycogen，提完之后测下RNA的量

细胞数目为3×10的6次方，悬浮在100微升的ＰＢＳ中，加入了600微升Trizol,裂解10分钟，充分混匀，随后加入了120微升氯仿，手动震荡2分钟，4°离心10分钟，取上清500微升加入等体积的异丙醇，离心没有沉淀
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9楼2011-04-29 14:05:09
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liby

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 17:43:11
可以继续往下做，我提的时候最后是用乙醇沉淀，也看不见，但用70%乙醇清洗的时候，就有了。而且有时候肉眼是看不清的
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10楼2011-04-29 17:22:39
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