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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] RNA提取问题

从细胞中提取RNA,在加入Trizol后,混匀,室温放置10分钟,目的是RNA和蛋白分离,然后加入氯仿,促使RNA进入水相中,12000转,离心10分钟,取上清转移至新管,加入等体积的异丙醇,目的为了使RNA沉淀,可是离心后没有沉淀,我不知道还用不用继续往下做?出现这种情况的原因在哪儿?请各位指教
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:52:29
可能是肉眼看不见吧,不能完全确定没有,最好还是往下做做看
2楼2011-04-29 08:23:02
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xuguanghai

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:52:34
有可能是氯仿残留,多加点异丙醇试一试
3楼2011-04-29 08:31:33
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gagalady

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+2): 2011-04-29 13:52:41
加完TRIzol后,要立即把细胞裂解,这一步要求快,放十分钟没必要,5分钟就ok;
加氯仿之后,要用力震荡,(用最大的力气),这步是也要放置一会的吧
此步之后高速4度离心15分钟吧
之后就是把上清洗出来(1ml TRIzol 的话 没必要吸出很多 300微升 就很多了,吸多了 不保险呀)
异丙醇我都加 500微升  加进去要枪头混匀,之后静置10min,低温不利于沉淀哦,室温,之后4度离心,沉淀很少的,不过对着光 用肉眼看 还是很能看清楚的。
多提取几次 就利索了
4楼2011-04-29 08:53:18
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

具体点
1. 初始细胞量多少?
2. 氯仿量?
3. 取上清的量?
4. 异丙醇的量?

如果上述都正常,可在异丙醇沉淀的时候加点glycogen,提完之后测下RNA的量
生活是美好的
5楼2011-04-29 08:54:53
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:54:47
加异丙醇时还需加入高盐溶液,才能沉淀。
6楼2011-04-29 09:39:36
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花的泪

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 13:55:08
其实核酸本来就是无色的絮状物,楼主想看到的白色沉淀是变性的蛋白。很可能你抽出来的RNA量很少。
7楼2011-04-29 13:15:56
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by lixg at 2011-04-29 09:39:36:
加异丙醇时还需加入高盐溶液,才能沉淀。

买过来的试剂中没有要求加入盐溶液,所以就没有加
8楼2011-04-29 13:54:14
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by nuoyaeva at 2011-04-29 08:54:53:
具体点
1. 初始细胞量多少?
2. 氯仿量?
3. 取上清的量?
4. 异丙醇的量?

如果上述都正常,可在异丙醇沉淀的时候加点glycogen,提完之后测下RNA的量

细胞数目为3×10的6次方,悬浮在100微升的PBS中,加入了600微升Trizol,裂解10分钟,充分混匀,随后加入了120微升氯仿,手动震荡2分钟,4°离心10分钟,取上清500微升加入等体积的异丙醇,离心没有沉淀
9楼2011-04-29 14:05:09
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liby

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+1): 2011-04-29 17:43:11
可以继续往下做,我提的时候最后是用乙醇沉淀,也看不见,但用70%乙醇清洗的时候,就有了。而且有时候肉眼是看不清的
10楼2011-04-29 17:22:39
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