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琼脂糖凝胶电泳相关知识
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找了些有关电泳的知识，希望能帮助各位朋友，同时希望各位友友，提供相关的知识，希望大家多交流！谢谢！！ ------ [ Last edited by 1949stone on 2013-7-4 at 10:50 ] |
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4楼2011-04-22 22:46:42
★ ★ ★
1949stone(金币+3): 鼓励 2011-04-24 13:35:39
1949stone(金币+3): 鼓励 2011-04-24 13:35:39
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原理 琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。 蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 操作流程 准备干净的配胶板和电泳槽 注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。 选择电泳方法 一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。 正确选择凝胶浓度 对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。 适合的电泳缓冲液 常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。 电泳的合适电压和温度 电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象 DNA样品的纯度和状态 是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。 DNA的上样 正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。TIANGEN公司DNA分子量标准每次上样6ul即可得到清晰均匀的条带。 Marker的选择 DNA电泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。TIANGEN公司的DNA Marker条带清晰，亮度均匀，质量稳定，是您实验的首选。需要注意的是Marker的电泳同样也要符合DNA电泳的操作标准。如果选择λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要预先65℃加热5min，冰上冷却后使用。从而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接头导致的片段连接不规则或条带信号弱等现象。 凝胶的染色和观察 实验室常用的核酸染色剂是溴化乙啶（EB），染色效果好，操作方便，但是稳定性差，具有毒性。而其他系列例如SYBR Green，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。TIANGEN公司的GeneGreen相比则是性价比高的低毒替代染料，其灵敏度比传统EB染料高10倍以上。注意观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，出现条带模糊的现象。 |
2楼2011-04-22 21:52:52
★
1949stone(金币+1): 鼓励 可以直接放到第一个里面 2011-04-24 13:36:04
1949stone(金币+1): 鼓励 可以直接放到第一个里面 2011-04-24 13:36:04
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要跑琼脂糖凝胶电泳， 5ng 就能很清楚的跑出来是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？ 参考见解：5ng 已经可以了，但是或许20ng50ng-200ng效果好，在此范围内呈线性。 把210bp的pcr产物进行酶切,得到190+20bp的两个片段,请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗?用多大浓度的胶和多大的电压呢? 参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开,电压不变,可用1.5%到2%的胶,20bp得片断不一定能看得到,所以应用未酶切的PCR片断作对照. 琼脂糖浓度（W/V） 大小范围（bp） 0.6% 1000-23000 0.8% 800-10000 1.0% 400-8000 1.2% 300-7000 1.5% 200-4000 2% 100-3000 丙烯酰胺凝胶电泳更适合于分离纯化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以达到1个bp。所以建议进行丙烯酰胺凝胶电泳试试。 Marker做琼脂糖凝胶电泳，发现Marker在加样孔有一个明显的亮带，什么原因？ 参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。 琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的? 参考见解： DNA带模糊??： 1、 DNA降解??避免核酸酶污染。 2、 DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。 3、 所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、 DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 5、 有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。 6、 DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。好象没跑出来，是怎么回事？ 参考见解： 1、 根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。 2、 紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。 3、 最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。 4、 电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。 内切酶酶切后应该产生300+74+25bp的3个片段，用琼脂糖凝胶电泳能不能跑得开？如果能，得用多少浓度？ 参考见解： 1、 分是分的开的，只是不知道要不要看到这条带，如果只是对多个样本的分析的，那是完全没有问题的。用2.5~3.0%的胶跑过，不同样本间是肯定看的到的。当然，25BP这条带是看不到的。 2、 用10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳来进行电泳分离，可以分开的。不过缓冲液要用0.5的TBE，不要用TAE，其效果差些。下面是10ml的配方： 30％丙烯酰胺母液 3.3 ml 5 × TBE 1ml 10% A.P 70 ul TEMED 5ul 120v 1.5h 在pH7.6的TBE缓冲液中进行质粒（DNA）的琼脂糖凝胶电泳时质粒向哪一极运动，为什么？如在DNA样品中加足够的亚精氨后再电泳会发生什么现象，为什么？ 参考见解： 1、 DNA分子在碱性凝胶缓冲液中带负电荷，在电场中由负极向正极迁移。 2、 样品中加足够的亚精氨后,亚精胺头部的强阳极性使整个分子高度亲和于DNA，DNA与碱性亚精胺结合,结合分子带阳离子。 在琼脂糖电泳时0.5CM孔DNA上样量不宜超过500ng;可是当组分不同时可加20~30ug这是怎么回事? 参考见解：单个条带不超过500ng，如果有很多条带的话，总量500ng可能就会少了点，条带不清晰。 怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？ 参考见解： 1、 跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。 2、 在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。5、2、4、6，因为，如果质粒的量很浓的话，通过简单的对一条条带的目测产生的结果误差是很大的或者利用marker(推荐DL 2000),再用软件做半定量分析。 变性单链DNA在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中迁移率与什么有关？应该选用什么marker？marker上样时要变性吗？ 参考见解：电泳迁移率(mobility)：如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中，使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E，即： F = QE (1)带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’，对于球形颗粒来说，在自由溶液中此阻力服从Stock定律： F’ = 6π r η v (2)这里v是在介质粘度为η的溶液中，半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。 当带电颗粒达到稳态运动时，F=F’，由(1)、(2)式推导出： v Q ——— = ———— （3） E 6πr η 不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同，其泳动速度用迁移率（或称泳动度）m来表示，定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下，颗粒在时间t中迁移距离d(cm)，即在单位电场强度(1 V/cm)时的泳动速度： v d m = —— = ——— (4) E t•E 将(3)代入(4)，得到 Q m = ———— (5) 6πr 由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下，某物质的迁移率为常数，是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2•s-1•V-1。 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？ 参考见解：过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。 一个让PAGE胶很快聚合的方法： 不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？ 参考见解： 1、 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。 2、 电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。 3、 上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。 跑出的DNA带模糊？ 参考见解： 1、 DNA降解：避免核酸酶污染。 2、 电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 3、 所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 4、 DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。 5、 DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 6、 有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。 7、 DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。 有不规则DNA带迁移? 参考见解： 1、 对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。 2、 电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。 3、 DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？ 参考见解： 1、 DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。 2、 DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。 3、 DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 4、 对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。 跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事? 参考见解：? 1、 小DNA带走出凝胶??缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 2、 分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。 3、 DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。 DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？ 参考见解：有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。 跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？ 参考见解：还有个问题，pcr的产物可以不可以直接拿来做模板再进行pcr。我试过，可是总是出现一个拖尾亮条，没有带，是什么原因呢？ 割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。 凝胶回收DNA实验的关键在哪里? 参考见解：最关键的是切胶之后,溶胶的那一步.切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净,按照实验步骤,第一步应该是将胶充分的溶化.这以后步一定要做充分,保证凝胶已经完全溶解了.加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度 的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。 切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？ 参考见解：可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。|||RNA 用具要用10%的NaOH浸泡过液，再用DEPC水冲洗干净 70%的乙醇用过 国产分析乙醇有杂质， RNA酶还会有，并带入其它污染||| |
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