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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求助
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化工人2010

木虫 (小有名气)

[求助] SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求助

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电压、电流与跑电泳时间怎么确定啊， 恒压 还是恒流  浓缩胶和分离胶浓度由什么决定啊
我做的是羊毛的溶解，附件是我的羊毛蛋白的电泳图 条件：分离胶15%, 浓缩胶5%, 垂直平板电泳, 加样量为7μL。电极缓冲液为Tris-HCl( pH 8.3)系统。电流40mA，浓缩胶电压100v，分离胶电压150v。
条带很模糊，这是什么原因啊 。是不是羊毛的溶解 分子量较杂 还是因为蛋白溶液不纯的原因呢？
我不想测很精确 只想知道一个大概的范围 你看我们的谱图 是不是只要染上色的地方 就能说是有那个范围的蛋白吗 就是4.1KD-66KD的蛋白都有吗  我们现在又买了一个14.4KD-96KD的marker 不过还是那样  很模糊，整个柱都有颜色
郁闷！
哪位做过凝胶电泳的虫友给指点一下 啊
不胜感激！
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我还年轻，我渴望上路。
1楼2011-04-20 20:55:00
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
silicare(金币+5, EPI+1): 2011-04-21 08:35:54
ladder跑得好，说明电泳胶、电泳液、电压电流没问题，给我的感觉是
1、拖带
样品中整个泳道都看不出明显的单条蛋白质带，说明有可能样品的制备有问题。
2、形状
样品中即使是拖带，从加样孔到后面，形状也不是呈倒梯形，而是中间有突出，所以我猜测可能有蛋白质样品在内，而且不止是一种蛋白质。
3、上样量
考马斯亮蓝染色还是比较敏感的，这么蓝，说明可能蛋白质很多，建议做一个上样量梯度，可以将样品进行2倍为一个梯度，做几个稀释梯度再上样跑，看看会不会有蛋白质条带。
4、样品处理
我跑SDS-PAGE从来不煮，所以我觉得不煮也没关系，反正已经有SDS了，但是稳妥起见，还是煮了算了，起码减少一个不确定因素。
5、浪费
一块胶10个上样孔，你有五个没用上，下次设计严谨一些，总会有些有趣的东西可以一起跑的。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
3楼2011-04-20 22:22:55
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Allen206

银虫 (小有名气)
样品有问题，制备出来先用盐析或者其他方法沉淀一下，不加变性剂不行，加一个试试，带型会不会变化
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不想说什么，，，，
14楼2013-09-05 14:02:27
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普通回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

★ ★
silicare(金币+2): 有道理 2011-04-21 08:36:04
化工人2010(金币+5): 2 2011-04-21 11:59:00
看你的marker跑的还是不错的，所以你的电泳可能也不存在什么问题。不知道你羊毛溶解用的是什么溶剂。。。溶解之后有煮一下变性么?
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
2楼2011-04-20 21:22:53
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化工人2010

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-04-20 21:22:53:
看你的marker跑的还是不错的，所以你的电泳可能也不存在什么问题。不知道你羊毛溶解用的是什么溶剂。。。溶解之后有煮一下变性么?

不用煮了吧！我们的羊毛蛋白溶液就是在80℃下溶解得到的，不过我们加不加SDS，跑出来都是那样
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我还年轻，我渴望上路。
4楼2011-04-21 12:47:41
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我要长大

银虫 (初入文坛)
Marker跑的不错，要不做个样品梯度稀释？？
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5楼2011-06-26 17:07:53
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hooroberts

新虫 (小有名气)
★ ★
silicare(金币+2): 谢谢参与 2011-06-27 17:19:33
样品制备有问题
你那浓缩胶是不是做得太短了
其实电压也可以调小一点，我浓缩胶15mA，分离胶25mA
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6楼2011-06-26 23:56:03
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skynoline

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
silicare(金币+3, EPI+1): 鼓励新虫参与 2011-06-27 12:01:13
引用回帖:
Originally posted by 化工人2010 at 2011-04-20 20:55:00:
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电压、电流与跑电泳时间怎么确定啊， 恒压 还是恒流  浓缩胶和分离胶浓度由什么决定啊
我做的是羊毛的溶解，附件是我的羊毛蛋白的电泳图 条件：分离胶15%, 浓缩胶5%, 垂直平板电泳, 加样 ...

marker跑的还是很不错的，我觉得1.可能是样品处理有问题，有拖尾现象，可能是样品里有小的不溶物，处理的时候先沸水煮5分钟，然后再离心5分钟。2.你的样品浓度是不有些大，上样量和浓度有关，一般是V=13/C。3.即使你没有那么多样，泳道也不要空着，空的泳道用水代替样品来跑。4.我觉得可能你的电压稍稍有点大。
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7楼2011-06-27 09:09:46
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susanbao

铁虫 (初入文坛)
溶解蛋白是不是用的盐酸胍，看你这图就像，用TCA沉淀，加点上样buffer，煮十分钟，上样量做个剃度，少上点
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8楼2011-06-27 09:13:06
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
浓度太高啦
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生物资源交流QQ群：1044518333
9楼2011-06-27 09:14:16
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化工人2010

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susanbao at 2011-06-27 09:13:06:
溶解蛋白是不是用的盐酸胍，看你这图就像，用TCA沉淀，加点上样buffer，煮十分钟，上样量做个剃度，少上点

TCA是三醋酸纤维素吗？上样量做个梯度式什么意思啊？谢谢回答。
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我还年轻，我渴望上路。
10楼2011-06-27 09:25:45
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