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化工人2010木虫 (小有名气)
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[求助]
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳求助
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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的电压、电流与跑电泳时间怎么确定啊， 恒压 还是恒流 浓缩胶和分离胶浓度由什么决定啊 我做的是羊毛的溶解，附件是我的羊毛蛋白的电泳图 条件：分离胶15%, 浓缩胶5%, 垂直平板电泳, 加样量为7μL。电极缓冲液为Tris-HCl( pH 8.3)系统。电流40mA，浓缩胶电压100v，分离胶电压150v。 条带很模糊，这是什么原因啊 。是不是羊毛的溶解 分子量较杂 还是因为蛋白溶液不纯的原因呢？ 我不想测很精确 只想知道一个大概的范围 你看我们的谱图 是不是只要染上色的地方 就能说是有那个范围的蛋白吗 就是4.1KD-66KD的蛋白都有吗 我们现在又买了一个14.4KD-96KD的marker 不过还是那样 很模糊，整个柱都有颜色 郁闷！ 哪位做过凝胶电泳的虫友给指点一下 啊 不胜感激！  |
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【答案】应助回帖
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silicare(金币+5, EPI+1): 2011-04-21 08:35:54
silicare(金币+5, EPI+1): 2011-04-21 08:35:54
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ladder跑得好，说明电泳胶、电泳液、电压电流没问题，给我的感觉是 1、拖带 样品中整个泳道都看不出明显的单条蛋白质带，说明有可能样品的制备有问题。 2、形状 样品中即使是拖带，从加样孔到后面，形状也不是呈倒梯形，而是中间有突出，所以我猜测可能有蛋白质样品在内，而且不止是一种蛋白质。 3、上样量 考马斯亮蓝染色还是比较敏感的，这么蓝，说明可能蛋白质很多，建议做一个上样量梯度，可以将样品进行2倍为一个梯度，做几个稀释梯度再上样跑，看看会不会有蛋白质条带。 4、样品处理 我跑SDS-PAGE从来不煮，所以我觉得不煮也没关系，反正已经有SDS了，但是稳妥起见，还是煮了算了，起码减少一个不确定因素。 5、浪费 一块胶10个上样孔，你有五个没用上，下次设计严谨一些，总会有些有趣的东西可以一起跑的。 |
3楼2011-04-20 22:22:55
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