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【求助/交流】大家来看下我的RNA电泳图
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我想做反转录，然后扩增目的条带，不知道RNA提得可以吗？第一个泳道不知道为什么跟其他的不一样？ |
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11楼2011-04-23 22:07:33
2楼2011-04-18 06:48:11
3楼2011-04-18 09:30:10
4楼2011-04-18 13:17:02
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wolfebst(EPI+1): 回答不错 2011-04-18 14:36:44
tutufei(金币+5): 谢谢你的建议！ 2011-04-23 00:04:47
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
wolfebst(EPI+1): 回答不错 2011-04-18 14:36:44
tutufei(金币+5): 谢谢你的建议！ 2011-04-23 00:04:47
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其实提取RNA的条件没那么苛刻，在普通的通风橱里就可以操作，外源RNase的污染比较好消除，关键是破壁时的内源降解。如果用trizol法就必须考虑trizol的量。 另外，相同的方法提取不同细菌的RNA效果也不一样。比如霍乱用trizol法提取效果极差，而沙门菌提取效果就较好；所以霍乱菌最好是用试剂盒过柱子提取，然后浓缩。我提取的是大肠杆菌，摸索了好几种方法，最后确定也是qiagen 的kit提取，然后浓缩。 另外，有一种可以喷的液体，叫做RNase抑制剂，用于消除表面RNase的污染，在客观条件不是很好的时候很有效。 最后祝lz实验顺利，好运啊！ |
5楼2011-04-18 14:25:16
6楼2011-04-18 17:57:03
7楼2011-04-23 00:06:38
8楼2011-04-23 15:38:37
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
scelab(金币+9, EPI+1): 很好很强大 2011-04-23 18:09:57
tutufei(金币+5): 谢谢，不好意思我的电泳最上面的条带才是最小的，不是DNA，可是就算少量DNA污染，还是会扩增出目的条带啊，那不就影响结果了吗？ 2011-04-23 21:55:56
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scelab(金币+9, EPI+1): 很好很强大 2011-04-23 18:09:57
tutufei(金币+5): 谢谢，不好意思我的电泳最上面的条带才是最小的，不是DNA，可是就算少量DNA污染，还是会扩增出目的条带啊，那不就影响结果了吗？ 2011-04-23 21:55:56
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关于你提的RNA的质量： 1.顶上的亮带是基因组DNA。如果是Trizol法提的，那就可能是抽提之后取上清时取得太多，吸到了中间相。以后这一步不用贪多的。 如果是检测表达量差异，那么基因组DNA混在cDNA里面，会干扰结果。如此多的基因组DNA污染，不能拿来定量。 所幸，你的目的只是拿来扩增目的条带，那这个没关系，你的RNA可以用  2.RNA量质量可以从中间两条rRNA的带看出来，你这两条带都有点拖尾，RNA有部分降解，第一个泳道最严重。 3.第一个泳道出现弥散状，中间两条rRNA的亮带都看不到，是很典型的RNA降解。 4.关于两条rRNA带亮度的差异，两倍是理论值，实际上往往不是这样，不用强求啦。 关于反转录引物的选择： 反转录可分为两种，一种是反转录出总的cDNA,另一种是只反转录你所需的目的基因的cDNA。 1.反转录出总的cDNA：有两种通用引物，一种是随机寡肽，它可以结合到随机位点，并且它的5‘端和3’端都有羟基，都可以介导反转录；另一种是Oligo dT，可以和mRNA的Poly A尾巴结合，但不能介导其他RNA的反转录。Takara的试剂盒同时提供两种引物，并建议两种引物一起用。我觉得如果都有的话，最好一起用。 2.反转录出目的基因的cDNA：这个只能设计特异的引物了。跟PCR引物设计类似。 |
9楼2011-04-23 18:04:13
囧10楼2011-04-23 22:05:03
12楼2011-04-23 22:13:39
