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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 【求助/交流】大家来看下我的RNA电泳图
汕头大学海洋科学接受调剂
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tutufei

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】大家来看下我的RNA电泳图

我想做反转录，然后扩增目的条带，不知道RNA提得可以吗？第一个泳道不知道为什么跟其他的不一样？
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1楼 2011-04-17 22:32:22
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-04-23 22:05:03:
囧
扩增目的条带的话，如果有基因组DNA的扩增，那大小会和cDNA扩增产物不一样的，后续可以通过胶回收得到想要的产物。当然如果内含子很小，可能在胶上看不出来。

我提的是细菌RNA，没有内含子吧
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11楼2011-04-23 22:07:33
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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wolfebst(金币+1): 鼓励多多交流 2011-04-18 08:11:57
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-04-17 22:32:22:
我想做反转录，然后扩增目的条带，不知道RNA提得可以吗？第一个泳道不知道为什么跟其他的不一样？

不知lz提取的是什么东东的RNA？

我提过细菌的total RNA。从lz的电泳图来看，质量不好。RIN值太低，表明降解严重。
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2楼2011-04-18 06:48:11
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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rainwander(金币+1, EPI+1): 相应管理员号召，开始加大EPI给予力度~ 2011-04-18 13:22:07


提取的大肠杆菌total RNA，可以用来做转录组分析的。大条带应该是小条带亮度的两倍最好，最差也得亮度差不多，对应的数量差不多。

祝lz实验顺利！

[ Last edited by zhaohq1209 on 2011-4-18 at 09:31 ]
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3楼2011-04-18 09:30:10
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-18 06:48:11:
不知lz提取的是什么东东的RNA？

我提过细菌的total RNA。从lz的电泳图来看，质量不好。RIN值太低，表明降解严重。

提的就是细菌的total RNA，没办法，实验室没做过RNA，所以条件不好，这个电泳没加变性剂
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4楼2011-04-18 13:17:02
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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wolfebst(EPI+1): 回答不错 2011-04-18 14:36:44
tutufei(金币+5): 谢谢你的建议！ 2011-04-23 00:04:47
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-04-18 13:17:02:
提的就是细菌的total RNA，没办法，实验室没做过RNA，所以条件不好，这个电泳没加变性剂

其实提取RNA的条件没那么苛刻，在普通的通风橱里就可以操作，外源RNase的污染比较好消除，关键是破壁时的内源降解。如果用trizol法就必须考虑trizol的量。

另外，相同的方法提取不同细菌的RNA效果也不一样。比如霍乱用trizol法提取效果极差，而沙门菌提取效果就较好；所以霍乱菌最好是用试剂盒过柱子提取，然后浓缩。我提取的是大肠杆菌，摸索了好几种方法，最后确定也是qiagen 的kit提取，然后浓缩。

另外，有一种可以喷的液体，叫做RNase抑制剂，用于消除表面RNase的污染，在客观条件不是很好的时候很有效。

最后祝lz实验顺利，好运啊！
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5楼2011-04-18 14:25:16
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wang7x7x

金虫 (小有名气)
★
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你的样品可能有基因组污染，跑个MOPS电泳看看吧，还可以看看纯度指标，检测下260与280的比值。
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6楼2011-04-18 17:57:03
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tutufei

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2011-04-18 14:25:16:
其实提取RNA的条件没那么苛刻，在普通的通风橱里就可以操作，外源RNase的污染比较好消除，关键是破壁时的内源降解。如果用trizol法就必须考虑trizol的量。

另外，相同的方法提取不同细菌的RNA效果也不一样。 ...

再请教个问题，细菌RNA做反转录时，引物怎么选择，是选随机引物吗
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7楼2011-04-23 00:06:38
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-04-23 00:06:38:
再请教个问题，细菌RNA做反转录时，引物怎么选择，是选随机引物吗

可以用随机引物将RNA翻转成cDNA；也可以用特异引物直接翻转特异的片段。
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8楼2011-04-23 15:38:37
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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scelab(金币+9, EPI+1): 很好很强大 2011-04-23 18:09:57
tutufei(金币+5): 谢谢，不好意思我的电泳最上面的条带才是最小的，不是DNA，可是就算少量DNA污染，还是会扩增出目的条带啊，那不就影响结果了吗？ 2011-04-23 21:55:56
引用回帖:
Originally posted by tutufei at 2011-04-17 22:32:22:
我想做反转录，然后扩增目的条带，不知道RNA提得可以吗？第一个泳道不知道为什么跟其他的不一样？

关于你提的RNA的质量：
1.顶上的亮带是基因组DNA。如果是Trizol法提的，那就可能是抽提之后取上清时取得太多，吸到了中间相。以后这一步不用贪多的。
如果是检测表达量差异，那么基因组DNA混在cDNA里面，会干扰结果。如此多的基因组DNA污染，不能拿来定量。
所幸，你的目的只是拿来扩增目的条带，那这个没关系，你的RNA可以用
2.RNA量质量可以从中间两条rRNA的带看出来，你这两条带都有点拖尾，RNA有部分降解，第一个泳道最严重。
3.第一个泳道出现弥散状，中间两条rRNA的亮带都看不到，是很典型的RNA降解。
4.关于两条rRNA带亮度的差异，两倍是理论值，实际上往往不是这样，不用强求啦。

关于反转录引物的选择：
反转录可分为两种，一种是反转录出总的cDNA,另一种是只反转录你所需的目的基因的cDNA。
1.反转录出总的cDNA：有两种通用引物，一种是随机寡肽，它可以结合到随机位点，并且它的5‘端和3’端都有羟基，都可以介导反转录；另一种是Oligo dT，可以和mRNA的Poly A尾巴结合，但不能介导其他RNA的反转录。Takara的试剂盒同时提供两种引物，并建议两种引物一起用。我觉得如果都有的话，最好一起用。
2.反转录出目的基因的cDNA：这个只能设计特异的引物了。跟PCR引物设计类似。
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9楼2011-04-23 18:04:13
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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囧
扩增目的条带的话，如果有基因组DNA的扩增，那大小会和cDNA扩增产物不一样的，后续可以通过胶回收得到想要的产物。当然如果内含子很小，可能在胶上看不出来。
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10楼2011-04-23 22:05:03
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
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Originally posted by tutufei at 2011-04-23 22:07:33:
我提的是细菌RNA，没有内含子吧

那其实可以直接用基因组DNA扩增目的片段呀，为什么要提RNA再反转录呢？
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12楼2011-04-23 22:13:39
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