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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大肠杆菌转化PCR鉴定，没有阳性菌落
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lijunj

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】大肠杆菌转化PCR鉴定，没有阳性菌落 已有5人参与

最近再做克隆，用菌液PCR做的筛选，对照组有明显的目的条带，而实验组一个没有。大家说，我有必要提几个质粒做酶切吗
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我是一只小小的鸟儿，希望通过自己早起，有份吃的
1楼 2011-04-15 22:50:17
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
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西瓜(金币+3): 鼓励 2011-04-16 14:47:37
引用回帖:
Originally posted by lijunj at 2011-04-15 22:50:17:
最近再做克隆，用菌液PCR做的筛选，对照组有明显的目的条带，而实验组一个没有。大家说，我有必要提几个质粒做酶切吗

既然对照组条带出来了，应该不是PCR的问题，很有可能是没有阳性克隆。建议把载体片段重新酶切，再做一次，不放心的话可以把那几个克隆提质粒酶切验证。请参考：http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3069329
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
3楼2011-04-16 09:20:49
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★
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西瓜(金币+2): 鼓励 2011-04-15 23:57:30
如果你是做了一次PCR，那么可以再重复一次PCR看看，如果确实还是没有目的条带就没有必要提取质粒了，很有可能没有连接上。。。重新连接吧。。
赞一下(2人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-15 23:00:44
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xiajungang

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-04-19 18:59:49
建议楼主采用质粒的通用引物来做验证，连接上有带，连接不上也有带（质粒自身一段），只不过是大小不同，很有说服力的。
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吃苦耐劳，勇于创新，乐观热情，积极向上！
4楼2011-04-19 17:07:53
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Arrennew

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
正好这几天实验室有人也出这问题，邪门儿的是用蓝白筛选，长的有蓝有白，挑白菌作PCR，一连挑了50多个都没有，再作一遍，结果阳性率就挺高，问我为什么，这谁知道啊，实验这东西不客观不行，出了问题没准你最先排除的几个不可能因素就是关键因素，这我倒是经历过。分子生物学侥幸一般是阴性，所以还不如大不了重来，也不多费多长时间。
赞一下(1人) 回复此楼
生命不息，探索不止。
5楼2011-04-19 21:17:46
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