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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分类鉴定的时候，为什么pcr之后还要做TA克隆，转化，然后将序列测序呢？
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kaludefeiyu

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】分类鉴定的时候，为什么pcr之后还要做TA克隆，转化，然后将序列测序呢？

在做菌株分类鉴定的时候，为什么对菌株提了DNA，pcr之后还进行TA克隆，转化，然后将阳性克隆进行PCR之后再去测序呢？这样的好处是什么呢？希望大家知道的多多指教啊，非常感谢啊！！！！！
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1楼 2011-03-16 14:54:43
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1368116楼: Originally posted by chenxiang29 at 2012-11-01 09:29:06
请问不可以直接连接到表达质粒上吗，然后测序...

引物上面设计好酶切位点，可以直接构建在表达载体
或者采用infusion gateway之列的试剂盒也可以
不过效率要远低于TA克隆
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6楼2012-11-01 14:34:27
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roomofxw

木虫 (正式写手)
kaludefeiyu(金币+1): 说的清楚，明白了，谢谢 2011-03-17 09:14:22
kaludefeiyu(金币+1): 2011-03-17 09:17:38
为了测序准确：
1. PCR产物是混合物，所以要连在载体上，挑单克隆测序。
2.测序结果两端有几十bp是测不准的，所有连在载体上，用载体上的测序引物，可以把目的基因置于可信区。
3.实验结果方便保存
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2楼2011-03-16 15:03:37
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kaludefeiyu

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by roomofxw at 2011-03-16 15:03:37:
为了测序准确：
1. PCR产物是混合物，所以要连在载体上，挑单克隆测序。
2.测序结果两端有几十bp是测不准的，所有连在载体上，用载体上的测序引物，可以把目的基因置于可信区。
3.实验结果方便保存

想问一下，怎么就能确定连在载体上的就是我们所需要的那个片段呢啊，它只能连16SRDNA,不可以连上引物吗？还有我们一般选用什么样的载体啊，
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3楼2011-03-17 10:06:13
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roomofxw

木虫 (正式写手)
kaludefeiyu(金币+3): 谢谢 2011-06-01 15:15:08
引用回帖:
Originally posted by kaludefeiyu at 2011-03-17 10:06:13:
想问一下，怎么就能确定连在载体上的就是我们所需要的那个片段呢啊，它只能连16SRDNA,不可以连上引物吗？还有我们一般选用什么样的载体啊，

连到T载体上以后，蓝白斑筛选，阳性克隆提质粒做酶切鉴定或者菌落PCR，然后送测序。具体一点参见T vector说明书
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4楼2011-03-17 10:46:53
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