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tutufei

铜虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】细菌总RNA的提取和RT-PCR

1.第一次做细菌总RNA的提取，很担心RNA会降解，请问需要注意哪些？
（菌体培养阶段所用的器皿，枪头需要DEPC水浸泡吗，还是从菌体离心开始提取RNA时才要求所有东西要RNase-free？）
2.我只要检测RNA的转录情况，只需要反转录成CDNA的第一链，帮忙推荐下RT-PCR试剂盒，哪个公司的好用？

[ Last edited by tutufei on 2011-3-2 at 18:20 ]

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1楼2011-03-02 18:09:18

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nininini

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★
lstt09nk(金币+4): 鼓励新虫交流，欢迎常来 2011-03-03 16:51:06
tutufei(金币+10): 很详细，谢谢 2011-03-12 11:40:17

简单说说我的一点儿建议吧
首先菌体培养很重要，一定要做了种子液，菌体状态不好RNA肯定质量不高；
关于提取的器皿什么的玻璃的180度烘烤，枪头离心管各种试剂之类的用新开口的，把枪头盒什么的用酒精好好擦擦，即使国产也可以凑合用，用DEPC水泡过灭菌当然更好~~
提取过程中保证环境的清洁，少说话，最好戴个口罩吧，手套建议用橡胶手套，一次性的用着太不方便，反而容易污染~离心机最好放在自己实验的台子上，接触离心管的部位大概擦擦，也为了预防吧~
在离心管开关口的过程小心，避免手接触到管口，防止有杂物落入~~自己试着提几次，熟就好了，没有想象的那么困难，如果不是完全定量的部分讲解也是可以接受的~~
我没怎么用试剂盒，RNA提取，DNA消化、反转都是自己弄的，没用试剂盒，你可以根据自己需要对比一下~
希望这些对你有用

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5楼2011-03-03 14:23:01

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zhengfan1109

银虫 (正式写手)

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★ ★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-03-02 18:48:44
翱宇(金币+1): 鼓励交流！ 2011-03-05 14:58:55
tutufei(金币+3): 谢谢 2011-03-12 11:37:13

引用回帖:

Originally posted by tutufei at 2011-03-02 18:09:18:
1.第一次做细菌总RNA的提取，很担心RNA会降解，请问需要注意哪些？
（菌体培养阶段所用的器皿，枪头需要DEPC水浸泡吗，还是从菌体离心开始提取RNA时才要求所有东西要RNase-free？）
2.我只要检测RNA的转录情况， ...

注意事项比较多，从提取阶段开始，培养阶段正常就行。所有枪头，离心管都要用DEPC水浸泡，灭菌。如果要做电泳，电泳槽也用DEPC水浸泡一下更好。

如果只要第一链，那用两步法就行，我当时用的是PROMIGA公司的逆转录酶，而且没用试剂盒，DIY。效果不错。

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2楼2011-03-02 18:23:25

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