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yicao917

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】请教凝胶电泳pH的问题

本人准备进行电泳实验但有些问题还没搞清楚，跪求过路大虾帮助，在此谢过先！以下是本人的问题：
1、SDS-PAGE中为什么制备分离胶时用pH8.8的缓冲液，而制备浓缩胶时则用pH6.8的缓冲液，能不能用其他pH的缓冲液比如pH8的缓冲液制胶？
2、制备浓缩胶和分离胶的缓冲液虽然不同，但随着电泳的进行电泳缓冲液应该会渗入胶中，那么胶的缓冲液pH能维持多久？这是否与电泳时间掌握有关？
3、碱性蛋白的非变性电泳中采用如下配方：
分离胶：0.06 mol/L KOH，0.376 mol/L乙酸，pH4.3（7.7 %T，2.67 % C）；
浓缩胶：0.06 mol/L KOH，0.063 mol/L乙酸，pH6.8（3.125 %T，25 %C）；
为什么分离胶的pH还是小于浓缩胶，小弟的酶不幸是碱性蛋白并且对酸不稳定，不想在pH4.3下进行非变性电泳，能否在pH7左右电泳？

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1楼 2011-02-26 21:16:09

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dorisdan

金虫 (小有名气)

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scelab(金币+9): 鼓励新虫！欢迎多来交流！:tiger06: 2011-02-26 23:12:13
yicao917(金币+30): 2011-03-01 12:27:58

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。
因此，考虑浓缩胶和分离胶的pH时还要考虑电泳缓冲液。

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