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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR引物二聚体问题
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】PCR引物二聚体问题 已有5人参与

急求帮助。下面是我的目的序列：
TGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCCTACCTGATCCGAGGTCAACTGGAGGGTGTGGTGGTTTCACGGCGTGACCGCCTCCGCGCTCCCGGTGCGAGGTTCTCAGCGAGCTACTGCGCAGGGGAGCCGCGGCGGGGTCGCCACTGCGTTTAGGGGGCGGCGCGGGGCCGTGACCCCCAAGGCCGGGCCCCGCCGCCGCGAGGCGGGGGGCTCGAGGGTTGAGATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAGTGCTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGGTTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTGCTTGCTTCTTGACTGAGAGATGCCACTGCGACAGGAGGGTCTGGGGGTCCTCCGGCGGGCGCCCTGGTCCGGGCCCTGGGGCGCCGGGGCGGTCCCGCCGAGGCAACTGCTGTGGTGTTCGCAGGGGGTTTGGGAGTGGTGACTCGATAATG；选用的引物为GTCAAGAAGCAAGCAAAGGAATC与TCAACTGGAGGGTGTGGTGG，在上述序列中已用括号隔开。我的实验目的是同属物种真伪鉴别，用这对引物只有正品获得目的条带，伪品没有，问题是均存在非特异扩增，从电泳图上来看应该是引物二聚体导致的。现在用SYBR实时荧光PCR来定性，实验结果一致，溶解曲线图谱中引物二聚体的峰明显，倒是不影响结果判断。Tm值阴性71.7°，阳性78.3与88.7°；Ct值阴性34，阳性19.
        因为用探针法时间来不及，想请教大家，避免引物二聚体我该怎么将现有的引物加以改进呢；还有阴性和阳性非特异扩增的Tm值差异是什么导致的呢。
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1楼 2011-01-19 15:03:44
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
电泳图呢？
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2楼2011-01-19 21:20:27
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
★
silicare(金币+1): 鼓励上图 2011-01-20 08:24:37
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2011-01-19 21:20:27:
电泳图呢？



Tm单峰的为阴性，另两个为阳性

[ Last edited by lhm_hnyj on 2011-1-19 at 22:37 ]
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3楼2011-01-19 22:34:24
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 鼓励交流 2011-01-20 09:20:25
我觉得你这个阴性对照里面的引物二聚体是比较明显的，但你你怀疑的引物二聚体的位置为啥位置比较靠后啊？
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-01-19 22:43:13
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-01-19 22:43:13:
我觉得你这个阴性对照里面的引物二聚体是比较明显的，但你你怀疑的引物二聚体的位置为啥位置比较靠后啊？

是啊，缺乏这方面的理论基础，正是要向大家请教的问题之一
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5楼2011-01-19 22:54:46
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-01-19 22:43:13:
我觉得你这个阴性对照里面的引物二聚体是比较明显的，但你你怀疑的引物二聚体的位置为啥位置比较靠后啊？

对不起，看了电泳图，发现应该是非特异性扩增，那我该咋办呢，都已经是60°退火延伸了
赞一下 回复此楼
6楼2011-01-19 23:04:09
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-01-20 09:20:46
引用回帖:
Originally posted by lhm_hnyj at 2011-01-19 23:04:09:

对不起，看了电泳图，发现应该是非特异性扩增，那我该咋办呢，都已经是60°退火延伸了

用的哪个marker  亮带不像是二聚体。
赞一下(2人) 回复此楼
7楼2011-01-20 00:20:02
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zhp1984816

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-01-20 09:20:59
看电泳图应该不是二聚体，而是非特异扩增，你可以把退火温度再改高一点，或者可以直接试试72°二步法，还有就是你用的什么酶，有的酶特异性不好，选择更好一点的特异性强的酶
赞一下(2人) 回复此楼
相信自己的路。坚持并享受其中。
8楼2011-01-20 00:47:02
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
换引物吧，
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9楼2011-01-20 08:25:44
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lhm_hnyj

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2011-01-20 00:20:02:



用的哪个marker  亮带不像是二聚体。

DL2000，亮带为目的带350bp左右，有拖尾，的确是非特异扩增引起的，还挺严重
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10楼2011-01-20 08:31:41
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