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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】如何构建细菌的基因组表达文库
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hanxganvet

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】如何构建细菌的基因组表达文库

各位大侠，本人现在正在做细菌的基因组表达文库，遇到一些问题，想向论坛里的高手请教

     细菌基因组文库构建时细菌基因组和载体连接比例如何？
     构建一个500-3000bp的文库，克隆数在4万个左右，大约需要多少载体和基因组？

     连接时那个公司的连接酶比较好？
    去磷酸化时用碱性磷酸酶时，使用那个剂量比较好？
    构建文库必须用电转化吗？化学转化行不行？
    在线急等，越详细越好，谢谢了
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lingsheshidu

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1楼 2011-01-10 20:13:36
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lingsheshidu

金虫 (小有名气)
★
hanxganvet(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
13楼: Originally posted by luhaoHuang at 2012-09-12 19:53:04
我也现在在构建文库，但是我酶切的片段的大小在20kb之间，所以就一直卡在这里没办法进行，不知道用什么载体，和转化

你好，你做基因组表达文库了吗，你用的什么表达载体和菌株啊？
赞一下 回复此楼
18楼2015-03-11 05:52:24
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★ ★ ★
hanxganvet(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+3):good 2011-01-11 09:45:36
hanxganvet(金币+1): 2011-04-01 08:30:57
比例的问题要自己摸索。

载体和基因组的需求量视你的转化率及转化次数而定。一次提够就行了。

NEB、Promega的T4较好用

去磷酸化能用SAP则不用CIAP，用量根据推荐的来就OK。

为达克隆总数，转化次数越少则均一性越好。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-01-10 20:50:00
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zmw_520

禁虫 (小有名气)
★
hanxganvet(金币+1):谢谢参与
hanxganvet(金币+1): 2011-04-01 08:31:06
本帖内容被屏蔽
3楼2011-01-10 21:23:35
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
dhd997(金币+2):谢谢交流 2011-01-11 09:45:53
hanxganvet(金币+1): 2011-04-01 08:31:09
引用回帖:
Originally posted by zmw_520 at 2011-01-10 21:23:35:

SAP比CIAP好在哪？？？谢谢~~~我不去磷酸化可以吗？？？

SAP比CIAP失活更彻底，不会妨碍后面的连接反应。单酶切不去磷酸化，你等着挑自连的克隆么？
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4楼2011-01-10 21:27:34
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zhjzh0029楼
2011-01-11 08:59   回复  
hanxganvet(金币+1):谢谢参与
hanxganvet(金币+1): 2011-04-01 08:31:25
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