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晓想

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
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[交流] 【求助/交流】请问一下毕赤酵母胞外表达载体pPICZaA线性化的问题已有2人参与

请问一下：我用毕赤酵母胞外表达载体pPICZaA，已经克隆好了，后面做转化之前要先用Sac1或者Bst X1两种酶进行线性化，可我老是切不出来，这是怎么回事呢？按说单酶切应该很容易的，质粒我也用试剂盒提过，不管手工还是试剂盒都切过，都不行，切了好多次，原始质粒和酶切质粒跑胶看起来没差别，像是在一条线上，这是为什么呢？

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1楼2010-12-29 17:29:01

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落明逐暗

金虫 (正式写手)

好吃嘴班班长

应助: 0 (幼儿园)
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散金: 4
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在线: 99.7小时
虫号: 742854
注册: 2009-04-08
性别: MM
专业: 微生物与生化药学

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流，欢迎常来生物版 2011-03-01 18:28:36

呃，不是还有PmeI吗？楼主可以用这个试一下吧，NEB的酶比较有保障。我也是这个质粒，用了XbaI和XhoI，单酶切和双酶切都做过，效果很好（虽然这两个不是线性化用途）。
另外，LZ怎么确定没线性好的？只是跟原始比对吗？问题是质粒本身就会有很多形态出现，还是跟同样是线性的Marker比较要好一点吧？

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天涯静处无征战，兵气销为日月光。

3楼2011-03-01 14:52:22

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fxtch

木虫 (小有名气)

应助: 1 (幼儿园)
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在线: 108.6小时
虫号: 921689
注册: 2009-12-06
性别: GG
专业: 生物化学

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

有没有测序？！首先确定一下质粒没有搞错。可以尝试下用其他限制性内切酶切一下，看下大小对不对，如果也切不开可能就是质粒的问题了。

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2楼2010-12-31 11:27:54

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