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晓想

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请问一下毕赤酵母胞外表达载体pPICZaA线性化的问题 已有2人参与

请问一下:我用毕赤酵母胞外表达载体pPICZaA,已经克隆好了,后面做转化之前要先用Sac1或者Bst X1两种酶进行线性化,可我老是切不出来,这是怎么回事呢?按说单酶切应该很容易的,质粒我也用试剂盒提过,不管手工还是试剂盒都切过,都不行,切了好多次,原始质粒和酶切质粒跑胶看起来没差别,像是在一条线上,这是为什么呢?
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fxtch

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
有没有测序?!首先确定一下质粒没有搞错。可以尝试下用其他限制性内切酶切一下,看下大小对不对,如果也切不开可能就是质粒的问题了。
2楼2010-12-31 11:27:54
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落明逐暗

金虫 (正式写手)

好吃嘴班班长

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1): 鼓励交流,欢迎常来生物版 2011-03-01 18:28:36
呃,不是还有PmeI吗?楼主可以用这个试一下吧,NEB的酶比较有保障。我也是这个质粒,用了XbaI和XhoI,单酶切和双酶切都做过,效果很好(虽然这两个不是线性化用途)。
另外,LZ怎么确定没线性好的?只是跟原始比对吗?问题是质粒本身就会有很多形态出现,还是跟同样是线性的Marker比较要好一点吧?
天涯静处无征战,兵气销为日月光。
3楼2011-03-01 14:52:22
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