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janet0313

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】有关蛋白

为什么我做的蛋白在浓缩过程中会出现沉淀，怎样防止沉淀的生成？
我做的蛋白还要做其他实验，是不是要PH值在蛋白等电点以外就可以防止沉淀生成？
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1楼 2010-12-28 10:57:53
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
janet0313(金币+1): 2010-12-28 17:09:17
janet0313(金币+1): 2010-12-28 17:13:34
将你的蛋白质的等电点，分子量大小及缓冲液组成成分列出来看看。
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2楼2010-12-28 11:13:51
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laoshu16

银虫 (小有名气)
janet0313(金币+1): 2010-12-28 17:09:22
引用回帖:
Originally posted by janet0313 at 2010-12-28 10:57:53:
为什么我做的蛋白在浓缩过程中会出现沉淀，怎样防止沉淀的生成？
我做的蛋白还要做其他实验，是不是要PH值在蛋白等电点以外就可以防止沉淀生成？

高浓度的蛋白本来就很容易沉淀出来了吧
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3楼2010-12-28 11:45:56
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janet0313

银虫 (小有名气)
等电点怎么测啊，我还不太清楚？
蛋白分子量25KDa，用的缓冲溶液时HEPES
该怎么办啊？
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4楼2010-12-28 17:11:12
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janet0313

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by laoshu16 at 2010-12-28 11:45:56:

高浓度的蛋白本来就很容易沉淀出来了吧

怎么样能防止他沉淀呢？
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5楼2010-12-28 17:12:29
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janet0313

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-28 11:13:51:
将你的蛋白质的等电点，分子量大小及缓冲液组成成分列出来看看。

等电点怎么测啊？分子量25KDa 缓冲溶液是Tris，或HEPES
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6楼2010-12-28 17:13:21
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
janet0313(金币+1): 2010-12-29 13:28:18
引用回帖:
Originally posted by janet0313 at 2010-12-28 17:13:21:


等电点怎么测啊？分子量25KDa 缓冲溶液是Tris，或HEPES

。。。。。。起码也加一点盐吧，离子强度也太低了点，少说也加个50mM的NaCl啊。我建议你在Tris或者HEPES里加 100mMNaCl，这样来纯化你的蛋白。

另外要用软件预测一下你的蛋白的等电点，然后再选pH。

你用什么方法浓缩的呢？超滤？

[ Last edited by brightfuture01 on 2010-12-28 at 17:40 ]
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7楼2010-12-28 17:38:55
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sanmaoecho

金虫 (小有名气)
janet0313(金币+1): 2010-12-29 13:33:02
高浓度的蛋白做浓缩的时候蛋白的物理环境应防止剧烈变化。
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8楼2010-12-28 19:14:29
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janet0313

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-28 17:38:55:



。。。。。。起码也加一点盐吧，离子强度也太低了点，少说也加个50mM的NaCl啊。我建议你在Tris或者HEPES里加 100mMNaCl，这样来纯化你的蛋白。

另外要用软件预测一下你的蛋白的等电点，然后再选pH。

...

浓缩用的是 Amicon ultrafilitration cell equipped with a YM-10 cellulose membrane
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9楼2010-12-29 13:31:58
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
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Originally posted by janet0313 at 2010-12-29 13:31:58:



浓缩用的是 Amicon ultrafilitration cell equipped with a YM-10 cellulose membrane

Amicon的超滤管也是我们最常用的，不知道你浓缩到多大浓度的时候会沉。
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10楼2010-12-29 13:33:30
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janet0313

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-29 13:33:30:


Amicon的超滤管也是我们最常用的，不知道你浓缩到多大浓度的时候会沉。

蛋白在40~50μM时，超低温冰箱放置过夜就会有沉淀，我们做蛋白是想做重组，重组好的就更容易沉了
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11楼2010-12-29 13:53:39
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by janet0313 at 2010-12-29 13:53:39:


蛋白在40~50μM时，超低温冰箱放置过夜就会有沉淀，我们做蛋白是想做重组，重组好的就更容易沉了

低温保存的时候加甘油了么？最后保存蛋白的缓冲液组成成分都有些什么呢？
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12楼2010-12-29 14:02:01
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janet0313

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-29 14:02:01:


低温保存的时候加甘油了么？最后保存蛋白的缓冲液组成成分都有些什么呢？

用SP-Sepharose柱纯化后直接超低温冰箱保存了，纯化时用50mM Tris-HCl 平衡，用500mM NaCl + Tris-HCl 洗脱，纯化好的蛋白浓缩后直接超低温冰箱保存了
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13楼2010-12-29 15:08:01
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