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chendarid0

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】提血液RNA浓度很低,怎样使其浓度高从而用于反转录 已有8人参与

请高手出手相救啊
提取血液RNA的浓度很低,用于下面的20ul反转录体系(最大的rna量不能超过1ug),我是900ng的rna来反转录,提取rna浓度太低,加入的rna体积会超过20ul体系,怎么办。
我也尝试过将2管获得的血液组织合并成一管,离心去上清,取下面的(应该含有很多血细胞),然后加1ml trizol提取rna,可是还是很低。
如果血液不离心的话那么我们用的一般的ep管里就盛不下1mltrizol和血液了,那如果血液很多,trizol很少(小于1ul)的话可能也提不好吧。
可不可以找一个大一点的ep管,然后将几管的血液合并在这个管子里,然后再加适量trizol来提取rna。
请各位高手哥哥姐姐指点一二,小弟不尽感激。
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三人行必有我师
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

建议

★ ★
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silicare(金币+1):浓缩是一个方法 2010-12-21 11:46:37
多提几管之后用乙醇沉淀,加少量水溶解
未来天空才是极限
2楼2010-12-19 19:39:47
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

多谢回复,请看我的思路可行否

引用回帖:
Originally posted by randomqd at 2010-12-19 19:39:47:
多提几管之后用乙醇沉淀,加少量水溶解

我 的血液组织材料较少,分成好几管来提肯定会损失很多。我可以找一个大的ep管如2ml,把几管血液材料都并在这一个管里,只加很少的trizol来提取,这样就会损失少一些,可以吗?请问trizol加入少量如0.2ul,可以吧,谢谢 ,请指教
三人行必有我师
3楼2010-12-20 10:15:47
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

TRIZOL太少

★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-20 15:42:00
RNA提的质量应该不好。RT对RNA质量要求还是挺高的
未来天空才是极限
4楼2010-12-20 14:07:32
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-20 15:42:14
做PCR的话,安啦~最后都放大几百万倍,能做出来的
5楼2010-12-20 14:09:31
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

血液提取需要液氮研磨吗

引用回帖:
Originally posted by randomqd at 2010-12-20 14:07:32:
RNA提的质量应该不好。RT对RNA质量要求还是挺高的

血液提取rna,用液氮研磨血液冷冻固态 是不是比直接在血液溶液中加trizol效果好啊  谢谢
三人行必有我师
6楼2010-12-20 14:40:56
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-20 15:42:26
RT产物做PCR的话没必要纠结RNA的量太少
只要提取、RT、PCR过程没问题的话,该有就会有的

只不过是一旦没有出现期望的结果时,会考虑到有可能是这方面的因素
7楼2010-12-20 14:44:31
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chendarid0

银虫 (初入文坛)

好的谢谢

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-12-20 14:44:31:
RT产物做PCR的话没必要纠结RNA的量太少
只要提取、RT、PCR过程没问题的话,该有就会有的

只不过是一旦没有出现期望的结果时,会考虑到有可能是这方面的因素

好的 谢谢
三人行必有我师
8楼2010-12-20 14:46:55
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★ ★
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dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-21 08:29:00
你提的是全血RNA?可是一般的都是替PBMC或白细胞的RNA啊。要是这样的话,你可以把红细胞裂解以后将白细胞收集到一个EP管中再提,Trizol的量不能太少,否则会影响RNA的提取效率的。如果是提取血浆中的病毒RNA,那你可以将血浆或血清单分出来再提啊。另外,象楼上所说,不要太计较总量的,因为还有反转录的步骤,所得产物足够你用了,还有就是找一个较高转录效率的反转录酶也就OK了
9楼2010-12-20 19:38:35
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宁夏8083

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
你提的是全血RNA?可是一般的都是替PBMC或白细胞的RNA啊。要是这样的话,你可以把红细胞裂解以后将白细胞收集到一个EP管中再提,Trizol的量不能太少,否则会影响RNA的提取效率的。如果是提取血浆中的病毒RNA,那你可以将血浆或血清单分出来再提啊。另外,象楼上所说,不要太计较总量的,因为还有反转录的步骤,所得产物足够你用了,还有就是找一个较高转录效率的反转录酶也就OK了
10楼2010-12-20 21:45:16
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