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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RNA干扰求助
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lhazrael

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】RNA干扰求助 已有3人参与

最近刚接触到RNA干扰，做的是丝状真菌，问人家要了一个载体 这载体的特点是有两个反向的启动子，直接用PCR从全基因组中得到目的基因的片段，然后插入到这两个启动子之间，就可以转录产生dsRNA，看起来挺方便的 我想问下目的基因序列已知，怎么选择插入的片段呢？有什么特别的要求吗？比如说长度，GC含量之类的。实验室没人做过，迷茫得很 请高手指导一下，不胜感激

附件是载体的图片

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1楼 2010-12-07 09:54:02
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

两建议。

★ ★ ★
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dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-14 15:15:46
一、现在有许多设计siRNA的网站，只要你把要沉默的目的基因放进去，设好参数就好了。自己找人合成siRNA
给你个网址
http://sysbio.kribb.re.kr:8080/AsiDesigner/designedSirna.jsf
设计的原则，自己找。。
二、找公司设计。。。
没做过真菌的沉默，不晓得它和动物有区别没？
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未来天空才是极限
2楼2010-12-07 11:03:05
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lhazrael

木虫 (正式写手)
这个类似于shRNA表达载体吧？也是用siRNA设计方法吗？我看设计出来的序列也就几十bp，可我看载体的参考文献，他插入了400bp呢，搞不太懂
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3楼2010-12-14 14:49:20
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)

自由人，我型我秀！

优秀版主
引用回帖:
Originally posted by lhazrael at 2010-12-14 14:49:20:
这个类似于shRNA表达载体吧？也是用siRNA设计方法吗？我看设计出来的序列也就几十bp，可我看载体的参考文献，他插入了400bp呢，搞不太懂

可以引用回复
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人生不过几十年，成败荣辱都在天，是非恩怨莫在意，健康快乐最值钱，自古人间苦无边，看得高远境如仙，愿你不为凡事恼，轻松快乐每一天。
4楼2010-12-14 15:16:09
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

可能因为你用的是真菌做为实验材料

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-15 09:03:04
呃，一楼给的是动物体内的shRNA设计，
你用的是真菌做为实验材料，沉默机制中的级联放大的作用，这和动物的有些不一样，可能一段大的dsRNA都可以吧，而且一般设计这么序列都是一下子设计四个序列，比较四个沉默效果，取最好的那个，
也就是说，麻烦点的，你取四个区域吧，选那个最好的
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未来天空才是极限
5楼2010-12-14 15:58:07
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lhazrael

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by randomqd at 2010-12-14 15:58:07:
呃，一楼给的是动物体内的shRNA设计，
你用的是真菌做为实验材料，沉默机制中的级联放大的作用，这和动物的有些不一样，可能一段大的dsRNA都可以吧，而且一般设计这么序列都是一下子设计四个序列，比较四个沉默效 ...

非常感谢，那这段序列是怎么选取呢？有专门的软件吗？
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6楼2010-12-15 08:39:30
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

你的载体是两个方向转录两条，我之前做的是一条两个短反向重复序列，在动物细胞体内

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。长度23个寡核苷酸可以更有效的；在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C；ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；中间的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效(AMBION use)；5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。；在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。
祝好
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未来天空才是极限
7楼2010-12-16 13:58:28
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lhazrael

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by randomqd at 2010-12-16 13:58:28:
中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。长度23个寡核苷酸可以更有效的；在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C；ShRNA目的序列的第一个 ...

有没有示意图呢？有点迷糊...
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8楼2010-12-16 14:17:56
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lhazrael

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by randomqd at 2010-12-16 13:58:28:
中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。长度23个寡核苷酸可以更有效的；在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C；ShRNA目的序列的第一个 ...

另外为什么在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T呢？如果是设计几百bp的序列，很难没有3个或3个以上的T的
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9楼2010-12-16 16:09:10
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randomqd

木虫 (小有名气)

樱花骑士

刚说了，我做的是23个核苷酸的

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
只是因为我用的启动子比如U6，碰到多个T会提前终止转录。。。
示意图？太麻烦了吧。其实就是回文结构，互补。。。
大家用的启动子不同。。。
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未来天空才是极限
10楼2010-12-16 16:42:26
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