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lhazrael木虫 (正式写手)
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【求助/交流】RNA干扰求助已有3人参与
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最近刚接触到RNA干扰，做的是丝状真菌，问人家要了一个载体 这载体的特点是有两个反向的启动子，直接用PCR从全基因组中得到目的基因的片段，然后插入到这两个启动子之间，就可以转录产生dsRNA，看起来挺方便的 我想问下目的基因序列已知，怎么选择插入的片段呢？有什么特别的要求吗？比如说长度，GC含量之类的。实验室没人做过，迷茫得很 请高手指导一下，不胜感激 附件是载体的图片  |
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dhd997(金币+2):谢谢交流 2010-12-14 15:15:46
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一、现在有许多设计siRNA的网站，只要你把要沉默的目的基因放进去，设好参数就好了。自己找人合成siRNA 给你个网址 http://sysbio.kribb.re.kr:8080/AsiDesigner/designedSirna.jsf 设计的原则，自己找。。 二、找公司设计。。。 没做过真菌的沉默，不晓得它和动物有区别没？ |
2楼2010-12-07 11:03:05
lhazrael
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4楼2010-12-14 15:16:09
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5楼2010-12-14 15:58:07
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你的载体是两个方向转录两条，我之前做的是一条两个短反向重复序列，在动物细胞体内
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中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。长度23个寡核苷酸可以更有效的；在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C；ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G；中间的茎环，5'TCAAGAG3'序列最为有效(AMBION use)；5-6个T必须放置在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录(stop)。；在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。 祝好 |
7楼2010-12-16 13:58:28
lhazrael
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8楼2010-12-16 14:17:56
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9楼2010-12-16 16:09:10
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