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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于荧光定量PCR的小问题,请高手指点 【问题已解决】
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在雨中

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】关于荧光定量PCR的小问题,请高手指点 【问题已解决】

使用百泰克的荧光定量PCR mix做定量,结束后没有做溶解曲线,而是走琼脂糖胶电泳确认效果. DNA是新提取的,质量可以保证.
第一次做的还可以,目的条带比较亮,NTC没有条带.几乎没有拖尾弥散现象.NTC下排后三个泳道.如图1
但过一段时间以后,同样PCR的条件,同样的操作,为啥那么多非特异扩增之类的东东?条带拖尾弥散..很是恶心....NTC无目标条带,但有拖尾....NTC是倒数第二第三泳道.如图2。
请教高手,是不是我后来的PCR的体系有问题? mix?水?有问题? 溶解引物和定容的水师天跟的无酶水,mix是新买的,应该都不会出问题呀?
请高手赐教!

[ Last edited by 在雨中 on 2010-12-9 at 13:07 ]
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1楼 2010-12-05 19:12:16
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wyzl2007

金虫 (小有名气)
在雨中(金币+1):谢谢应助. 2010-12-05 19:51:23
在雨中(金币+5):谢谢。问题已解决。 可能是定量的时候水的问题。现在做的非常完美了。 2010-12-09 13:09:18
你可以用普通PCR作验证一下！！！
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2楼2010-12-05 19:22:41
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
在雨中(金币+1):新提取的核酸,质量很高的... 2010-12-05 19:50:51
在雨中(金币+3):谢谢。问题已解决。 可能是定量的时候水的问题。现在做的非常完美了。 2010-12-09 13:09:28
推测是样本降解了，重新提一下核酸吧
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3楼2010-12-05 19:45:08
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★ ★
dhd997(金币+2):good 2010-12-06 08:25:03
在雨中(金币+10):斑竹把我批的。。。。谢谢您 2010-12-06 11:25:39
你的marker是什么，目的条带怎么会这么大？？

既然不是探针，为什么不加一个溶解曲线？

你所谓的成功的第一次的电泳照片呢？

上边是几对引物，貌似质量也不咋滴，有没有提取做一个普通PCR看看引物质量呢？

所以……
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4楼2010-12-06 08:20:25
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cyz20050505

木虫 (正式写手)
在雨中(金币+5):谢谢。问题已解决。 可能是定量的时候水的问题。现在做的非常完美了。 2010-12-09 13:08:57
引用回帖:
Originally posted by 在雨中 at 2010-12-05 19:12:16:
使用百泰克的荧光定量PCR mix做定量,结束后没有做溶解曲线,而是走琼脂糖胶电泳确认效果. DNA是新提取的,质量可以保证.
第一次做的还可以,目的条带比较亮,NTC没有条带.几乎没有拖尾弥散现象.NTC下排后三个泳道.如 ...

这种结果，得到的数据绝对不可信。
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5楼2010-12-09 12:11:42
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cyz20050505

木虫 (正式写手)
在雨中(金币+5):谢谢。问题已解决。 可能是定量的时候水的问题。现在做的非常完美了。 2010-12-09 13:08:51
建议重新设计引物，并优化反应条件
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6楼2010-12-09 12:12:17
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fzwish20000

新虫 (初入文坛)
重提核酸看看
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7楼2011-06-15 17:22:25
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bioch2012

木虫 (小有名气)
我想看一下图
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8楼2011-06-15 19:54:51
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