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铁虫 (初入文坛)

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[交流] 【求助/交流】求助：关于均一化cDNA文库构建和转录组测序的问题已有1人参与

想请教高手，我想构建均一化cDNA文库，但目前市场上没有相关试剂盒的产品。请问，如何构建，有无相关资料？
第二，关于转录组测序，有几个问题，网站上一般只有技术路线，但有些相关的细节没有透露。一是mRNA反转录到cDNA用的是什么技术，能否保证一链合成的效率。二是cDNA打断之后的分析工作是怎样的？

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1楼 2010-11-02 16:37:38

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holyala

木虫 (著名写手)

砖家

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scelab(金币+5):good 2010-11-02 17:40:29

第一个问题，均一化cDNA文库，据我所知，目前主要的方法是利用DSN酶（双链特异性核酸酶）来做的，具体的资料见以下链接
http://g.zhubajie.com/urllink.php?id=101364357fq9217ut6pxc9nm
第二个问题，如果你问的是高通量测序的话，目前转录组测序的大致流程是：mRNA纯化——RNA打断——反转录——测序接头连接——PCR扩增，反转录就是很普通的用N6 primer + superscriptII酶，一链合成效率还比较高，1μg total RNA起始基本上都能做成。
另外，cDNA打断也不是不行，但是有数据表明cDNA打断后测序的均一性不如mRNA打断的好，所以不推荐。至于你问的分析工作...不就是mapping+组装嘛，没什么特别的。

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