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wd519wd706银虫 (小有名气)
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【求助】求助关于毕赤酵母电转化的步骤及需要注意的事项，有做过的给个详细过程吧，谢
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xiaopeiliang
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wd519wd706(金币+15): 2011-04-09 10:29:59
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毕赤酵母的电转已经是很成熟的了，但是在实验的过程中往往是会遇到问题！ GS115菌株于50ml YPD摇到OD600约1.2-1.5，太高影响感受态效率 (1) 5000RPM离心5min，将离心管倒置在吸水纸上轻轻控几下，充分弃上清 (2) 加入10ml 冰浴的超纯水ddH2O，可在振荡器上振荡混匀，可静置3－5分钟 (3) 离心，弃上清，再加10ml ddH2O洗一遍 (4) 离心，弃上清，加10ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍 (5) 离心，弃上清，菌体置于冰浴中，加入约100－200ul Sorbitol混匀 加入Sorbitol量需自己调整，这时菌液很浓，只要能够用200ul黄枪头吸出来就可以了，一般共有约400－500ul，够做几管感受态了。 (7) 吸取100－150ul感受态到线性化的DNA中，用枪头打匀或手指弹匀 静置5min，于2mm电转化杯中，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆（不是400），一般放电时间在4.5-4.9ms之间，小于4说明你的DNA盐浓度太高 (9) 立即加入1ml Sorbitol，转入10ml 离心管，30度静置1小时，然后加入1ml YPD，30度，200rpm摇1小时，取50－200ul菌液涂100ul/ml YPDS板 (10) 一般转化效率可以达到：200个以上转化子每200ul菌液，足够筛选表达菌株了。 |
2楼2010-11-23 09:55:29