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银虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】热不对称PCR的问题，回帖就送金币！！多谢帮忙回答的，帮顶的！！已有12人参与

首先，热不对称PCR的好处是什么？它主要用来扩已知序列的旁侧基因，然后通过
一步步提高退火温度，最后达到P出一条带的目的。这样理解对吗？

其次，我现在做启动子的染色体步移，加了接头后。试剂盒也是推荐用热不对称PCR。但这时我知道我的接头序列，又知道我的已知序列，完全可以用普通PCR扩嘛。这样想对吗？

还有，不太理解接头引物AP和特异性引物GSP之间在片段长度和退火上的差异。试剂盒上的：AP1:22个碱基 51度退火 AP2:19， 57度。而建议我的GSP：25~28个碱基，退火和GC和AP差不多。为什么碱基数差那么多？

最后，2步法PCR（94度,64度）和3步法（94，退火，72度）有什么区别？好处是？

大家一起来讨论下这四个问题吧！！多谢了~~~谢谢！！！！
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1楼2010-10-17 16:53:38

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带刀猎人

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+2):谢谢参与 2010-10-18 11:46:52

楼上的太不厚道了，我说一下我的想法，呵呵
第一，你所说的热不对称PCR实际上是TOUCHDOWN PCR的逆过程，这是在模板量较少或这是引物与模板亲和力较弱时使用的，目的是前面低温退火经过低特异性的扩增获得大量的模板，在提高退火温度，进行特异性高的扩增，或得目的产物。
第二，普通PCR由于没有中间的基因特异性引物，这样就导致上下游引物之间的距离很长，也就是PCR的产物片段太长，从而使PCR得保真度降低，效率降低。所以在普通PCR的上下游引物之间加上GSP缩短的产物长度。
第三，解释不清楚，可以查一下Tm值除了GC含量外，还有其他的影响因素没。
第四，两步法PCR节约了时间，同时提高了退火温度，增加了特异性。
以上仅为个人己见，有不妥之处，望各为虫友指正，见谅。谢谢！