| 查看: 2541 | 回复: 13 | |||
| 【有奖交流】积极回复本帖子，参与交流，就有机会分得作者 oicqyutong 的 12 个金币 | |||
oicqyutong银虫 (小有名气)
|
[交流]
【求助/交流】western blot 一直都跑不出来，不知道原因，大侠给分析一下啊！？
|
||
|
大家好啊，本人系化学系一名学生，由于迫不得已，需要做western blot，从一点儿都不懂到现在能做走了很多弯曲的路。但是现在还没完全弄出来，又分析不出来原因，特来请教各位大虾们帮忙，小女子在此谢过了…… 我跑的蛋白是24kD的，做的是RNA的沉默。现在是连对照组都跑不出来。 分析可能原因为 1. 第一步的蛋白裂解没裂解好。我这次准备用的是1*10的6次方取3mL种到六孔板中，然后加60微升碧云天RIPA+PMSF裂解液。（之前是用的200微升裂解液裂解6孔板细胞） 请问这个裂解液上的说明说是几秒钟，我直接几秒就可以还是要裂解1小时呢？ 上样量我是用的20微升，上16微升加4微升上样缓冲液。 2. 跑胶问题我觉得应该是不大的，但是转膜的时候问题就来了。 转膜时间问题： 转膜的时候我用的是湿转（条件所限，没有别的方法，大虾不要挑这个毛病）。100V转2h，不知道有大侠做过的没？这个条件可以么？！但是我今天转的时候发现在用丽春红染色后，35KD下面的带颜色很浅，有时候几乎就是看不见，是转的时间忒长了还是转的时间短了呢？ β-actin是肯定转上了，还有什么转膜时候的问题我就不知道了，请大家根据我情况给个指导吧！ 3. 封闭我是选择的5%BSA封闭1h，1抗1h，2抗1h，每个中间每次TBST洗10分钟*3次。 我的1抗应该没什么问题。 我的2抗是鼎国的山羊抗兔IGg，上面说明是1：5000-1：100000比例稀释，我稀释到5000，第一次非特异。后来把用过一次的稀释到1：8000就没有非特异了， 但是我要的蛋白也没出来。后来一次我稀释到1：8000还非特异，我就很无奈！洗照片的时候在一片黑中好像看到了一丁点儿更黑，希望是我要的，但是这个也不能用啊。 4. 洗照片 我用的方法是ECL显色，β-actin能看出来有一条很亮的带，但是，一直都看不到24KD那条带，不知道怎么回事儿。我现在很无奈，请哪位大侠给讲解一下吧。。。万分感谢啊！ 小女子在此再次拜谢啦…… |
回复此楼» 猜你喜欢
阴阳离子交换剂！！！！
已经有3人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酸接酚羟基，
已经有11人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有174人回复
-
二苄基磷酰氯，磷酰氯
已经有10人回复
-
酸酐或者羧酸酰氯化
已经有15人回复
-
酚羟基接入磷酸，磷酸酯化
已经有26人回复
-
土壤中可溶性有机碳种类
已经有1人回复
-
韩国海关检测食用植物油中的苯并芘用的是哪种方法？
已经有0人回复
-
现有pP43NMK质粒，想换了pHT43，或者其他芽孢杆菌过表达质粒
已经有5人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- western-blot实验结果，大家帮忙分析下
已经有7人回复
- Western Blot实验的蛋白条带都连在一起
已经有37人回复
- western blot 求助，请高手指点一下
已经有8人回复
- Western blot 检测胱氨酸谷氨酸转运体蛋白表达
已经有6人回复
- 新手求助western blot
已经有22人回复
- 【分享】新手上路 Western blot问题集合
已经有6人回复
- 【求助/交流】western blot的内参总是不齐怎么办
已经有19人回复
- western blot 半干转膜后，发现条带个别缺失，不知道什么原因，请教各位
已经有1人回复
- 【求助/交流】western blot中的怪现象，求解~~~
已经有19人回复
- 【分享】western blot 使用技巧
已经有18人回复
- 【分享】个人整理 Western Blot(转）
已经有73人回复
- 做Western blot时荧光瞬间淬灭是什么原因？
已经有6人回复
oicqyutong
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 880.6
- 散金: 8
- 红花: 1
- 帖子: 159
- 在线: 49.6小时
- 虫号: 767623
- 注册: 2009-05-11
- 性别: MM
- 专业: 无机纳米化学
2楼2010-09-28 21:20:47
zhandeguo1
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 369.8
- 散金: 14
- 帖子: 128
- 在线: 20.8小时
- 虫号: 1065590
- 注册: 2010-07-28
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
3楼2010-09-28 21:26:28
zhandeguo1
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 369.8
- 散金: 14
- 帖子: 128
- 在线: 20.8小时
- 虫号: 1065590
- 注册: 2010-07-28
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
4楼2010-09-28 21:28:09
oicqyutong
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 880.6
- 散金: 8
- 红花: 1
- 帖子: 159
- 在线: 49.6小时
- 虫号: 767623
- 注册: 2009-05-11
- 性别: MM
- 专业: 无机纳米化学
5楼2010-10-12 21:39:39
oicqyutong
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 880.6
- 散金: 8
- 红花: 1
- 帖子: 159
- 在线: 49.6小时
- 虫号: 767623
- 注册: 2009-05-11
- 性别: MM
- 专业: 无机纳米化学
6楼2010-10-12 21:41:31
7楼2012-04-10 20:36:51
oicqyutong
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 880.6
- 散金: 8
- 红花: 1
- 帖子: 159
- 在线: 49.6小时
- 虫号: 767623
- 注册: 2009-05-11
- 性别: MM
- 专业: 无机纳米化学
8楼2012-04-10 20:45:02
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
| 裂解细胞时间很短就够了，基本上按照说明书说的就可以了。跑胶的浓度选择15%就可以了，转膜30min就可以了。一抗你可以试试过夜，这个条件比较好，要么室温2h，一抗1小时有些短了。其他的什么问题就没看出来了。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
oicqyutong9楼2012-04-11 13:11:13
10楼2012-04-11 13:11:57
25