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oicqyutong银虫 (小有名气)
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[交流]
【求助/交流】western blot 一直都跑不出来，不知道原因，大侠给分析一下啊！？
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大家好啊，本人系化学系一名学生，由于迫不得已，需要做western blot，从一点儿都不懂到现在能做走了很多弯曲的路。但是现在还没完全弄出来，又分析不出来原因，特来请教各位大虾们帮忙，小女子在此谢过了…… 我跑的蛋白是24kD的，做的是RNA的沉默。现在是连对照组都跑不出来。 分析可能原因为 1. 第一步的蛋白裂解没裂解好。我这次准备用的是1*10的6次方取3mL种到六孔板中，然后加60微升碧云天RIPA+PMSF裂解液。（之前是用的200微升裂解液裂解6孔板细胞） 请问这个裂解液上的说明说是几秒钟，我直接几秒就可以还是要裂解1小时呢？ 上样量我是用的20微升，上16微升加4微升上样缓冲液。 2. 跑胶问题我觉得应该是不大的，但是转膜的时候问题就来了。 转膜时间问题： 转膜的时候我用的是湿转（条件所限，没有别的方法，大虾不要挑这个毛病）。100V转2h，不知道有大侠做过的没？这个条件可以么？！但是我今天转的时候发现在用丽春红染色后，35KD下面的带颜色很浅，有时候几乎就是看不见，是转的时间忒长了还是转的时间短了呢？ β-actin是肯定转上了，还有什么转膜时候的问题我就不知道了，请大家根据我情况给个指导吧！ 3. 封闭我是选择的5%BSA封闭1h，1抗1h，2抗1h，每个中间每次TBST洗10分钟*3次。 我的1抗应该没什么问题。 我的2抗是鼎国的山羊抗兔IGg，上面说明是1：5000-1：100000比例稀释，我稀释到5000，第一次非特异。后来把用过一次的稀释到1：8000就没有非特异了， 但是我要的蛋白也没出来。后来一次我稀释到1：8000还非特异，我就很无奈！洗照片的时候在一片黑中好像看到了一丁点儿更黑，希望是我要的，但是这个也不能用啊。 4. 洗照片 我用的方法是ECL显色，β-actin能看出来有一条很亮的带，但是，一直都看不到24KD那条带，不知道怎么回事儿。我现在很无奈，请哪位大侠给讲解一下吧。。。万分感谢啊！ 小女子在此再次拜谢啦…… |
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| 裂解细胞时间很短就够了，基本上按照说明书说的就可以了。跑胶的浓度选择15%就可以了，转膜30min就可以了。一抗你可以试试过夜，这个条件比较好，要么室温2h，一抗1小时有些短了。其他的什么问题就没看出来了。 |
oicqyutong9楼2012-04-11 13:11:13
oicqyutong
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