应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】western blot 一直都跑不出来，不知道原因，大侠给分析一下啊！？
51/1返回列表
查看: 3207  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

oicqyutong

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】western blot 一直都跑不出来，不知道原因，大侠给分析一下啊！？

大家好啊，本人系化学系一名学生，由于迫不得已，需要做western blot，从一点儿都不懂到现在能做走了很多弯曲的路。但是现在还没完全弄出来，又分析不出来原因，特来请教各位大虾们帮忙，小女子在此谢过了……

       我跑的蛋白是24kD的，做的是RNA的沉默。现在是连对照组都跑不出来。
      分析可能原因为
     1. 第一步的蛋白裂解没裂解好。我这次准备用的是1*10的6次方取3mL种到六孔板中，然后加60微升碧云天RIPA+PMSF裂解液。（之前是用的200微升裂解液裂解6孔板细胞）
         请问这个裂解液上的说明说是几秒钟，我直接几秒就可以还是要裂解1小时呢？
        上样量我是用的20微升，上16微升加4微升上样缓冲液。

    2. 跑胶问题我觉得应该是不大的，但是转膜的时候问题就来了。
        转膜时间问题：
                转膜的时候我用的是湿转（条件所限，没有别的方法，大虾不要挑这个毛病）。100V转2h，不知道有大侠做过的没？这个条件可以么？！但是我今天转的时候发现在用丽春红染色后，35KD下面的带颜色很浅，有时候几乎就是看不见，是转的时间忒长了还是转的时间短了呢？
        β-actin是肯定转上了，还有什么转膜时候的问题我就不知道了，请大家根据我情况给个指导吧！

      3. 封闭我是选择的5%BSA封闭1h，1抗1h，2抗1h，每个中间每次TBST洗10分钟*3次。
         我的1抗应该没什么问题。
         我的2抗是鼎国的山羊抗兔IGg，上面说明是1：5000-1：100000比例稀释，我稀释到5000，第一次非特异。后来把用过一次的稀释到1：8000就没有非特异了， 但是我要的蛋白也没出来。后来一次我稀释到1：8000还非特异，我就很无奈！洗照片的时候在一片黑中好像看到了一丁点儿更黑，希望是我要的，但是这个也不能用啊。
       4. 洗照片
          我用的方法是ECL显色，β-actin能看出来有一条很亮的带，但是，一直都看不到24KD那条带，不知道怎么回事儿。我现在很无奈，请哪位大侠给讲解一下吧。。。万分感谢啊！


         小女子在此再次拜谢啦……
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
突然对科研有了兴趣，希望可以一直坚持下去！加油……
1楼 2010-09-28 21:19:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oicqyutong

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2393483楼: Originally posted by 快乐女孩h at 2012-04-10 20:36:51:
20至80KD一般100v 1h就够了，你的两小时可能过了，如果不是膜蛋白提取，你加了RIPA+PMSF后放在冰上1h左右，这样可以充分裂解细胞，β-actin本来就很容易检测，所以你能检测出来也是正常的

谢谢了。这个实验做的很纠结啊。呵呵……
赞一下 回复此楼
突然对科研有了兴趣，希望可以一直坚持下去！加油……
8楼2012-04-10 20:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

oicqyutong

银虫 (小有名气)

补充个~

哪位大侠有详细的western的跑过大概24KD左右的方法具体的资料给分一下，必定十万分的感谢啊！
赞一下 回复此楼
突然对科研有了兴趣，希望可以一直坚持下去！加油……
2楼2010-09-28 21:20:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhandeguo1

银虫 (小有名气)

western blotting

★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-09-28 22:50:11
oicqyutong(金币+3):谢谢您的转膜时间的评价，我想问一些具体的！ 2010-10-12 21:40:18
裂解的浓度6孔板60ul差不多了。上样量也应该没什么问题。这主要看你的一抗是否灵敏，一般这么多也够了。
裂解（RIPA+PMSF)时间我们一般是冰上30分钟。
'转膜时间应该是太长了，24KD  120V转半个小时差不多了。时间长了会转过的。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2010-09-28 21:26:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhandeguo1

银虫 (小有名气)

western blotting

怕转膜转丢的话可以在转膜buffer里加上20%的甲醇。这样小蛋白就不会那么容易被转过了。
赞一下 回复此楼
4楼2010-09-28 21:28:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 304求调剂 +7 司空. 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:08 by JourneyLucky
[考研] 317求调剂 +5 申子申申 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:26 by JourneyLucky
[考研] 药学383 求调剂 +3 药学chy 2026-03-15 5/250 2026-03-20 22:11 by 云游重阳
[考研] 329求调剂 +9 想上学吖吖 2026-03-19 9/450 2026-03-20 22:01 by luoyongfeng
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +5 tcxiaoxx 2026-03-20 5/250 2026-03-20 21:35 by laoshidan
[考研] 求调剂 +3 @taotao 2026-03-20 3/150 2026-03-20 19:35 by JourneyLucky
[考研] 261求B区调剂，科研经历丰富 +3 牛奶很忙 2026-03-20 4/200 2026-03-20 19:34 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工专硕调剂 +7 heming3743 2026-03-16 7/350 2026-03-20 19:31 by zhukairuo
[考研] 广西大学家禽遗传育种课题组2026年硕士招生（接收计算机专业调剂） +3 123阿标 2026-03-17 3/150 2026-03-20 15:58 by 飞行琦
[考研] 304求调剂 +5 曼殊2266 2026-03-18 5/250 2026-03-20 09:00 by ZHANG0tao
[考研] 266求调剂 +5 阳阳哇塞 2026-03-14 10/500 2026-03-19 15:08 by 阳阳哇塞
[考研] 材料与化工求调剂 +7 为学666 2026-03-16 7/350 2026-03-19 14:48 by 尽舜尧1
[考研] 328求调剂，英语六级551，有科研经历 +4 生物工程调剂 2026-03-16 12/600 2026-03-19 11:10 by 生物工程调剂
[考研] 一志愿华中科技大学，080502，354分求调剂 +4 守候夕阳CF 2026-03-18 4/200 2026-03-18 22:16 by li123456789.
[考研] 化学工程321分求调剂 +15 大米饭！ 2026-03-15 18/900 2026-03-18 14:52 by haxia
[考研] 0854可跨调剂，一作一项核心论文五项专利，省、国级证书40+数一英一287 +8 小李0854 2026-03-16 8/400 2026-03-18 14:35 by 搏击518
[考研] 考研求调剂 +3 橘颂. 2026-03-17 4/200 2026-03-17 21:43 by 有只狸奴
[考研] 一志愿南京大学，080500材料科学与工程，调剂 +4 Jy? 2026-03-16 4/200 2026-03-17 11:02 by gaoqiong
[考研] 机械专硕325，寻找调剂院校 +3 y9999 2026-03-15 5/250 2026-03-16 19:58 by y9999
[考研] 289求调剂 +4 这么名字咋样 2026-03-14 6/300 2026-03-14 18:58 by userper
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭