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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教：DNA浓度测定
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biolinshen

银虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】请教：DNA浓度测定 已有4人参与

手头有酶切后切胶纯化（OMEGA）样品两份， 用于qPCR定量。 所以要求对纯化后样品精确定量。100倍稀释后，测定浓度。 手头两台DNA浓度分光光度计，一台Eppendorf 的，一台岛津的。   对两份样品测定得出的浓度差异很大（35， 0）  vs (100, 45) 最主要问题还在于A 样本跑胶条带亮度远小于B样品。另外A260 /A 280 远小于 1.8. 我的问题

1. 有什么办法可以更好去除DNA样品中 蛋白等杂质呢？ 我提取的质粒DNA, 酶切后进行胶纯化， 难道还不能保证DNA的纯度？

2.  紫外分光光度计，对DNA浓度的测定准确度如何？  问了不少人，似乎对其精度都表示怀疑。

对各位的建议，谢过先！
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1楼 2010-09-11 19:41:29
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看天

木虫 (知名作家)
不知道 顶一下 希望有人能够帮助
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
2楼2010-09-11 20:34:56
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girlfisher

金虫 (小有名气)
biolinshen(金币+3):感谢您的建议 2010-09-11 21:33:15
biolinshen(金币+2): 2010-09-12 19:49:07
切胶纯化然后又稀释100倍，这种情况一般你的DNA含量低于1ng/uL，用分光光度计已经完全不准了。
至少也要用原始样品在低样品消耗的nanodrop上测含量，不过还是建议用内参来定量或者用更加准确的Qubit方法确定模板含量。
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3楼2010-09-11 20:54:08
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sdqzsdqz

木虫 (著名写手)
同意三楼
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4楼2010-09-11 23:11:12
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biolinshen

银虫 (初入文坛)
感谢这位， 你的回答给我很大的帮助。
引用回帖:
Originally posted by girlfisher at 2010-09-11 20:54:08:
切胶纯化然后又稀释100倍，这种情况一般你的DNA含量低于1ng/uL，用分光光度计已经完全不准了。
至少也要用原始样品在低样品消耗的nanodrop上测含量，不过还是建议用内参来定量或者用更加准确的Qubit方法确定模板 ...

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5楼2010-09-12 19:50:22
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priorpost06

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+5):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-09-15 23:23:33
比值小于1.8说明你的DNA样品含有蛋白质，含有蛋白质的话，测算DNA肯定不准，而且会影响到PCR，要保证大于或是等于1.8，不能差距太大。
提取DNA的时候，离心速度要大小适宜，才能去除蛋白质或是最大限度减少蛋白质。
一般细菌用 12000r/min.  1.5mL 的离心管。
用紫外测DNA久必须要用石英比色皿或是比石英更好的，对照和溶解DNA的溶液要超纯。
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6楼2010-09-12 20:00:51
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dongfangzz

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
好像用氯仿或是异丙醇就可以分离核酸和蛋白质吧
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7楼2010-09-12 20:16:54
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非池中物

过来学习一下
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8楼2010-09-12 20:22:11
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biolinshen

银虫 (初入文坛)
感谢priorpost06  的热情帮忙哈。 因为本身DNA浓度不是很高，蛮担心再苯酚氯仿之后，就没剩多少了。  看了岛津的说明书， 检测限说是上样浓度>2 微升。   所以降低稀释倍数，使上样浓度提高到检测限上。 再次用岛津和Eppendorf测定， 两者值基本一致。 但蛋白杂质还是存在且不低，  看来还得先大量富集之后再酚纯化了。   再次感谢各位的帮助
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9楼2010-09-15 11:24:29
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