应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接总是连不上，如何解决
111/2返回列表12下一页
查看: 1939  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xinyaolu

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接总是连不上，如何解决 已有10人参与

本人最近在将一段2500bp的片段连到8100bp的质粒上。片段先连到克隆载体上，但一直无法连到8100bp的质粒上。期间尝试了不同的摩尔比例，连接液使用Takare的solution I，16℃连接过夜，也尝试了电转，但很多情况下连假阳性都没有。已经做了3周了，还请高手们出招指教。非常感谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-08-28 11:15:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

怎么都行

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3):够细致 2010-08-28 13:06:28
LZ是把片段先连接到克隆载体上然后再切下来连到目的质粒上么？可能原因有下：
1  酶切回收的片段是你的目的片段么？
2  你的质粒和你的片段是用同样的内切酶切的么？（保证他们有相同的粘末端）
3  如果是单酶切，那你的质粒最好在连接片段前做去磷酸化处理，防止它在连接反应中自身环化。
4  尝试换一下连接体系，比如改用NEB的T4连接体系。
5  你的质粒不适宜在该种感受态细胞中扩增。
我能想到的原因就这些，实在不行，你要把整个过程重新来过，或许在构建的前期阶段某个失误导致后来的实验失败。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2010-08-28 12:01:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

j2

木虫 (正式写手)
你这么知道是没连上捏？
赞一下 回复此楼
修炼ｉｎｇ，当虫仙……
3楼2010-08-28 12:58:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

duckcat

银虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
直接用takara的T4连接酶不好吗，连接6个小时足矣！连不上就邪门了
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-08-28 15:34:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

danny0426

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):这个贼重要！ 2010-08-28 23:18:50
有没有排除感受态的问题？
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2010-08-28 21:59:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

微笑漩涡

新虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
倘若实在做不出来，可以考虑先连接T载体，然后酶切下来连现在的这个载体。
赞一下(1人) 回复此楼
6楼2010-08-28 23:12:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

linysm

银虫 (小有名气)
大片段连接确实不好连，看看有没有相关适合你用的试剂盒。加大目的片段的比例。
赞一下 回复此楼
7楼2010-08-29 10:46:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangrq_hu

木虫 (著名写手)
路过，学习学习
回复此楼
8楼2010-08-29 11:03:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinyaolu

木虫 (小有名气)
感谢大家的回复，这个质粒已经连上。
由于前面做的连接一直比较顺，从没有考虑过DNA浓度的问题。所以在不断的失败后，提高了载体和片段的浓度，载体150ng，片段和载体比例为10:1，载体和片段混合后65℃保温5分钟，随后冰上放置1分钟，加入solution I ，连接过夜，转化JM109。菌落PCR挑光了两块板子70个转化子，阳性的有3个。构建这个质粒前后一共挑了将近1000个转化子，终于连上。
赞一下 回复此楼
9楼2010-09-05 22:08:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hou88com

金虫 (小有名气)

为人低调
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
在其他条件都认为正确的前提下，查看你的酶切位点，如果是双酶切的话最好不是相邻的两个酶切位点。
赞一下(1人) 回复此楼
Timelysnowfortellsabumperharvest.
10楼2010-09-06 19:42:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xinyaolu 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 0805总分292，求调剂 +7 幻想之殇 2026-03-01 7/350 2026-03-01 21:22 by 公瑾逍遥
[考研] 299求调剂 +3 Y墨明棋妙Y 2026-02-28 5/250 2026-03-01 21:01 by tangxiaotian
[考研] 0856材料与化工，270求调剂 +3 YXCT 2026-03-01 3/150 2026-03-01 19:51 by 无懈可击111
[考研] 材料化工调剂 +10 今夏不夏 2026-03-01 11/550 2026-03-01 19:49 by 无懈可击111
[考研] 0856化工专硕求调剂 +12 董boxing 2026-03-01 12/600 2026-03-01 19:45 by 材子momo
[考研] 298求调剂 +6 axyz3 2026-02-28 6/300 2026-03-01 19:00 by 18137688336
[考研] 295求调剂 +7 19171856320 2026-02-28 7/350 2026-03-01 18:54 by 18137688336
[考研] 材料类求调剂 +10 wana_kiko 2026-02-28 11/550 2026-03-01 18:11 by 海嵙Y
[考研] 化工专硕348，一志愿985求调剂 +5 弗格个 2026-02-28 8/400 2026-03-01 17:25 by sunny81
[考研] 281求调剂 +4 2026计算机_诚心 2026-03-01 7/350 2026-03-01 17:20 by 2026计算机_诚心
[考研] 材料工程274求调剂 +3 Lilithan 2026-03-01 3/150 2026-03-01 14:58 by ms629
[考研] 317一志愿华南理工电气工程求调剂 +6 Soliloquy_Q 2026-02-28 11/550 2026-03-01 11:14 by 歌liekkas
[考研] 寻找调剂 +4 LYidhsjabdj 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:56 by sunny81
[考研] 311求调剂 +9 南迦720 2026-02-28 10/500 2026-03-01 10:55 by sunny81
[考博] 博士自荐 +4 kkluvs 2026-02-28 4/200 2026-03-01 10:19 by 馥安馥安
[硕博家园] 2025届双非化工硕士毕业，申博 +3 更多的是 2026-02-27 4/200 2026-03-01 10:04 by ztg729
[硕博家园] 博士自荐 +6 科研狗111 2026-02-26 10/500 2026-03-01 10:02 by 科研狗111
[考研] 272求调剂 +4 田智友 2026-02-28 4/200 2026-03-01 06:43 by 刘兵
[考研] 292求调剂 +3 yhk_819 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:57 by gaoxiaoniuma
[考研] 264求调剂 +3 巴拉巴拉根556 2026-02-28 3/150 2026-02-28 21:31 by gaoxiaoniuma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭