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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接总是连不上，如何解决
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xinyaolu

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】连接总是连不上，如何解决 已有10人参与

本人最近在将一段2500bp的片段连到8100bp的质粒上。片段先连到克隆载体上，但一直无法连到8100bp的质粒上。期间尝试了不同的摩尔比例，连接液使用Takare的solution I，16℃连接过夜，也尝试了电转，但很多情况下连假阳性都没有。已经做了3周了，还请高手们出招指教。非常感谢！
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1楼 2010-08-28 11:15:35
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怎么都行

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3):够细致 2010-08-28 13:06:28
LZ是把片段先连接到克隆载体上然后再切下来连到目的质粒上么？可能原因有下：
1  酶切回收的片段是你的目的片段么？
2  你的质粒和你的片段是用同样的内切酶切的么？（保证他们有相同的粘末端）
3  如果是单酶切，那你的质粒最好在连接片段前做去磷酸化处理，防止它在连接反应中自身环化。
4  尝试换一下连接体系，比如改用NEB的T4连接体系。
5  你的质粒不适宜在该种感受态细胞中扩增。
我能想到的原因就这些，实在不行，你要把整个过程重新来过，或许在构建的前期阶段某个失误导致后来的实验失败。
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2楼2010-08-28 12:01:24
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j2

木虫 (正式写手)
你这么知道是没连上捏？
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
3楼2010-08-28 12:58:44
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duckcat

银虫 (初入文坛)
★
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直接用takara的T4连接酶不好吗，连接6个小时足矣！连不上就邪门了
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4楼2010-08-28 15:34:21
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danny0426

新虫 (初入文坛)
★ ★
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silicare(金币+1):这个贼重要！ 2010-08-28 23:18:50
有没有排除感受态的问题？
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5楼2010-08-28 21:59:45
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微笑漩涡

新虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
倘若实在做不出来，可以考虑先连接T载体，然后酶切下来连现在的这个载体。
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6楼2010-08-28 23:12:20
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linysm

银虫 (小有名气)
大片段连接确实不好连，看看有没有相关适合你用的试剂盒。加大目的片段的比例。
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7楼2010-08-29 10:46:43
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zhangrq_hu

木虫 (著名写手)
路过，学习学习
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8楼2010-08-29 11:03:06
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xinyaolu

木虫 (小有名气)
感谢大家的回复，这个质粒已经连上。
由于前面做的连接一直比较顺，从没有考虑过DNA浓度的问题。所以在不断的失败后，提高了载体和片段的浓度，载体150ng，片段和载体比例为10:1，载体和片段混合后65℃保温5分钟，随后冰上放置1分钟，加入solution I ，连接过夜，转化JM109。菌落PCR挑光了两块板子70个转化子，阳性的有3个。构建这个质粒前后一共挑了将近1000个转化子，终于连上。
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9楼2010-09-05 22:08:31
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hou88com

金虫 (小有名气)

为人低调
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
在其他条件都认为正确的前提下，查看你的酶切位点，如果是双酶切的话最好不是相邻的两个酶切位点。
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Timelysnowfortellsabumperharvest.
10楼2010-09-06 19:42:34
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