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xinyaolu

木虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】连接总是连不上，如何解决已有10人参与

本人最近在将一段2500bp的片段连到8100bp的质粒上。片段先连到克隆载体上，但一直无法连到8100bp的质粒上。期间尝试了不同的摩尔比例，连接液使用Takare的solution I，16℃连接过夜，也尝试了电转，但很多情况下连假阳性都没有。已经做了3周了，还请高手们出招指教。非常感谢！

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1楼 2010-08-28 11:15:35

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linysm

银虫 (小有名气)

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大片段连接确实不好连，看看有没有相关适合你用的试剂盒。加大目的片段的比例。

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7楼2010-08-29 10:46:43

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怎么都行

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+3):够细致 2010-08-28 13:06:28

LZ是把片段先连接到克隆载体上然后再切下来连到目的质粒上么？可能原因有下：
1  酶切回收的片段是你的目的片段么？
2  你的质粒和你的片段是用同样的内切酶切的么？（保证他们有相同的粘末端）
3  如果是单酶切，那你的质粒最好在连接片段前做去磷酸化处理，防止它在连接反应中自身环化。
4  尝试换一下连接体系，比如改用NEB的T4连接体系。
5  你的质粒不适宜在该种感受态细胞中扩增。
我能想到的原因就这些，实在不行，你要把整个过程重新来过，或许在构建的前期阶段某个失误导致后来的实验失败。

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2楼2010-08-28 12:01:24

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