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sqhnsd金虫 (正式写手)
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[交流]
【求助】RP-HPLC分离蛋白质样品遇到的奇怪现象 已有5人参与
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本人最近在做RP-HPLC分离蛋白质 柱子：C8 孔径 300 A A液： 98% 水 2% 乙腈 0.1% TFA B液： 90% 乙腈 10%水 0.1% TFA 样本均为蛋白质复杂样本，每个组分大概包括50-100个左右的蛋白，只是分力量不同（楼下有图） A-B: <20KD C-H: 20-150 KD （c-h 分子量逐渐增大） A-B图分离效果还可以接受，但是C-H分离效果很差，不知道原因，请高手指点。 另外，我考虑可能是蛋白质分离比较大 300 A的孔径可能不合适，但是我改用1000A的柱子效果也差不多是这样。请有相关方面经验的高手指教。 |
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8楼2010-08-13 14:32:11
sqhnsd
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10楼2010-08-13 15:07:10
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电洗脱的时候，里面有200mM的glycine，在丙酮沉淀之前我还对样品进行冻干以提高蛋白浓度，增加 actone precipitation回收率。但是，当弄干之后，盐分盐浓度就很高了（200mM其实已经比较高了），高盐情况下去除SDS效果不好（文章推荐除盐）。还有，大部分蛋白在0-60%乙腈的条件下都会洗掉，90%跟100%差别不大。另外，actone precipitation可以去除大部分SDS，因此必须放到RP-HPLC之前。你说的很对，我也觉得丙酮沉淀之后的蛋白，怪怪的 [ Last edited by sqhnsd on 2010-8-13 at 15:14 ] |
11楼2010-08-13 15:11:38
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2楼2010-08-09 09:49:37
3楼2010-08-09 10:32:34
sqhnsd
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4楼2010-08-09 13:59:58
5楼2010-08-09 14:05:47
sqhnsd
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6楼2010-08-09 14:58:36
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zxz.1982(金币+1):感谢交流 2010-08-13 15:04:29
zxz.1982(金币+1):感谢交流 2010-08-13 15:04:29
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看着图确实很怪异， 怎么都不到基线呢？ 你为啥不用 A液： 100%水 0.1% TFA B液： 100% 乙腈 0.1% TFA 这样的话，在乙腈达到100%的时候，一切疏水的冻洗都应该下来，如果还不回到基线，那就说明你的样品有问题， 没有那个分子的有那么强的疏水性质。 看你的这个图，感觉分辨率很低。 另外你为啥要在丙酮沉淀去除盐和SDS后上HPLC，丙酮除掉盐的时候难道盐不会也析出来？ 按照经验，当样品中盐离子很高的时候，在用有机溶剂沉淀蛋白的时候，盐离子也是可以被沉淀下来的。反相柱子可以脱盐，但是多了对机器不好。 另外丙酮沉淀后，很多蛋白性质会很怪的，我想一般这一步不应该放在这么靠后。 电洗脱这个步骤也太靠前了，感觉， 感觉应该是你的样品含有某种东西，但是说不好是什么？ |
7楼2010-08-13 14:14:57
9楼2010-08-13 14:33:01
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