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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 化学化工区 » 分析 » 色谱质谱 » 【求助】RP-HPLC分离蛋白质样品遇到的奇怪现象
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sqhnsd

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】RP-HPLC分离蛋白质样品遇到的奇怪现象已有5人参与

本人最近在做RP-HPLC分离蛋白质
柱子：C8 孔径 300 A
A液： 98% 水     2% 乙腈 0.1% TFA
B液： 90% 乙腈  10%水   0.1% TFA
样本均为蛋白质复杂样本，每个组分大概包括50-100个左右的蛋白，只是分力量不同（楼下有图）
A-B: <20KD
C-H: 20-150 KD （c-h 分子量逐渐增大）
A-B图分离效果还可以接受，但是C-H分离效果很差，不知道原因，请高手指点。
另外，我考虑可能是蛋白质分离比较大 300 A的孔径可能不合适，但是我改用1000A的柱子效果也差不多是这样。请有相关方面经验的高手指教。
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1楼2010-08-09 09:48:58
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)
sqhnsd(金币+1): 2010-08-13 15:02:02
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Originally posted by 致死之眠 at 2010-08-09 14:05:47:
214nm干扰太大了，基线不稳是肯定的，飘的没法看

不过说的对， 对于大分子还是用280好， 214主要是针对小肽的。
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8楼2010-08-13 14:32:11
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 皖山潜凤 at 2010-08-13 14:32:11:




不过说的对， 对于大分子还是用280好， 214主要是针对小肽的。

呵呵，谢谢。我问了一下ABI的技术支持，他认为跟分子量分离效果相关的因素除了Pore size 之外，还跟固定相的C含量有关，他建议用下C4试试，好比C18不能分离蛋白一样的道理。280我用了，尽管信号很低，但是分离效果还是不好。214针对 peptide bond，比280灵敏，尤其当样品量比较低的生活，280可能没有214效果好。不过，很感谢你热心的回答。
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10楼2010-08-13 15:07:10
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 皖山潜凤 at 2010-08-13 14:14:57:





看着图确实很怪异，  怎么都不到基线呢？
你为啥不用
A液： 100%水 0.1% TFA
B液： 100% 乙腈   0.1% TFA

这样的话，在乙腈达到100%的时候，一切疏水的冻洗都应该下来，如果还不回到基线，那就说 ...

电洗脱的时候，里面有200mM的glycine，在丙酮沉淀之前我还对样品进行冻干以提高蛋白浓度，增加 actone precipitation回收率。但是，当弄干之后，盐分盐浓度就很高了（200mM其实已经比较高了），高盐情况下去除SDS效果不好（文章推荐除盐）。还有，大部分蛋白在0-60%乙腈的条件下都会洗掉，90%跟100%差别不大。另外，actone precipitation可以去除大部分SDS，因此必须放到RP-HPLC之前。你说的很对，我也觉得丙酮沉淀之后的蛋白，怪怪的

[ Last edited by sqhnsd on 2010-8-13 at 15:14 ]
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11楼2010-08-13 15:11:38
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
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2楼2010-08-09 09:49:37
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致死之眠

金虫 (知名作家)

梦幻初音
检测波长
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Iamendlishdi,Myenglishisveryhaoveryqiangda
3楼2010-08-09 10:32:34
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
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Originally posted by 致死之眠 at 2010-08-09 10:32:34:
检测波长

214 nm
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4楼2010-08-09 13:59:58
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致死之眠

金虫 (知名作家)

梦幻初音
sqhnsd(金币+1): 2010-08-09 14:58:45
214nm干扰太大了，基线不稳是肯定的，飘的没法看
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Iamendlishdi,Myenglishisveryhaoveryqiangda
5楼2010-08-09 14:05:47
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 致死之眠 at 2010-08-09 14:05:47:
214nm干扰太大了，基线不稳是肯定的，飘的没法看

可能不是这个原因，因为我的样品（蛋白质）经过丙酮沉淀，其它杂质比较少，应该比较纯。而且，前两张HPLC图可以看出复杂蛋白的分离还是可以的，只是后面的不行
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6楼2010-08-09 14:58:36
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)
★
zxz.1982(金币+1):感谢交流 2010-08-13 15:04:29
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Originally posted by sqhnsd at 2010-08-09 09:48:58:
本人最近在做RP-HPLC分离蛋白质
柱子：C8 孔径 300 A
A液： 98% 水     2% 乙腈 0.1% TFA
B液： 90% 乙腈  10%水   0.1% TFA
样本均为蛋白质复杂样本，每个组分大概包括50-100个左右的蛋白，只是分力量不同（ ...

看着图确实很怪异，  怎么都不到基线呢？
你为啥不用
A液： 100%水 0.1% TFA
B液： 100% 乙腈   0.1% TFA

这样的话，在乙腈达到100%的时候，一切疏水的冻洗都应该下来，如果还不回到基线，那就说明你的样品有问题， 没有那个分子的有那么强的疏水性质。



看你的这个图，感觉分辨率很低。  另外你为啥要在丙酮沉淀去除盐和SDS后上HPLC，丙酮除掉盐的时候难道盐不会也析出来？ 按照经验，当样品中盐离子很高的时候，在用有机溶剂沉淀蛋白的时候，盐离子也是可以被沉淀下来的。反相柱子可以脱盐，但是多了对机器不好。    另外丙酮沉淀后，很多蛋白性质会很怪的，我想一般这一步不应该放在这么靠后。



电洗脱这个步骤也太靠前了，感觉，


感觉应该是你的样品含有某种东西，但是说不好是什么？
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7楼2010-08-13 14:14:57
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皖山潜凤

银虫 (小有名气)
★
zxz.1982(金币+1):感谢交流 2010-08-13 15:04:57
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-08-09 14:58:36:

可能不是这个原因，因为我的样品（蛋白质）经过丙酮沉淀，其它杂质比较少，应该比较纯。而且，前两张HPLC图可以看出复杂蛋白的分离还是可以的，只是后面的不行

蛋白分子越小 ，用214准 但是越大  用280准，  214主要针对小肽
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9楼2010-08-13 14:33:01
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